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针对剪接体蛋白USP39通过变构配体和PROTAC诱导降解的研究报告

一、 主要作者、机构及发表信息 本研究由Daniel Schäfer（第一作者）和Xinlai Cheng*（通讯作者）领导的团队完成。研究团队主要来自德国法兰克福的多个研究机构，包括：约翰·沃尔夫冈·歌德大学布赫曼分子生命科学研究所、约翰·沃尔夫冈·歌德大学药物化学研究所、法兰克福癌症研究所、法兰克福大学医院Mildred-Scheel早期癌症研究中心、法兰克福大学医学院生物化学II研究所、马克斯·普朗克生物物理研究所理论生物物理学系、慕尼黑路德维希-马克西米利安大学化学系以及歌德大学生物物理研究所。研究成果以题为“Targeting the Spliceosomal Protein USP39 through Allosteric Ligands and PROTAC-Induced Degradation”的论文形式，于2025年发表在*Angewandte Chemie International Edition*期刊上（引用格式：Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e16809）。

二、 学术背景与研究目的 本研究的核心科学领域是化学生物学和靶向蛋白降解，具体聚焦于RNA剪接调控。RNA剪接是真核细胞基因表达的关键步骤，通过选择性剪接可以极大地增加蛋白质组的多样性。剪接过程的失调与包括癌症和神经退行性疾病在内的多种疾病密切相关。剪接体的核心组件之一是泛素特异性蛋白酶39（Ubiquitin-specific protease 39, USP39）。然而，与大多数USP家族成员不同，USP39缺乏催化活性所需的必需残基（如活性位点的组氨酸和半胱氨酸），因此它被认为是一个“非酶”功能的支架蛋白。近年研究表明，USP39的缺失会导致剪接体组装受损，引发蛋白毒性应激和细胞死亡，并在癌症发展中扮演关键角色，这使其成为一个有潜力的治疗靶点。但因其缺乏传统的酶活性口袋，通过传统小分子抑制剂靶向USP39极具挑战性，被视为“不可成药”靶点。

近年来，蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimera， PROTAC）技术为靶向这类“不可成药”蛋白提供了革命性策略。PROTAC是一种双功能分子，一端结合靶蛋白（POI），另一端招募E3泛素连接酶，从而诱导靶蛋白的多聚泛素化和随后的蛋白酶体降解。其优势在于不要求配体必须占据或抑制靶蛋白的活性位点，而是利用细胞自身的降解机制。

因此，本研究的目的在于：1）发现并鉴定能够与USP39结合的小分子配体；2）基于这些配体设计并优化靶向USP39的PROTAC分子；3）在细胞模型中验证PROTAC对USP39的降解效能、特异性及作用机制；4）通过验证USP39降解后引发的特定剪接模式变化，确认该策略的功能性后果和治疗相关性。

三、 详细研究流程与方法 本研究包含一系列逻辑严密的实验流程，从靶点验证、配体发现到PROTAC设计、优化及功能验证。

1. 靶点可降解性验证与配体筛选 首先，研究团队利用dTAG系统验证了USP39可以通过泛素-蛋白酶体途径降解。他们将FKBP12F36V结构域融合到USP39的N端，用dTAG13处理后成功诱导了融合蛋白的快速降解，证实了开发PROTAC降解剂的可行性前提。

接下来，他们采用了两种互补的化学筛选策略来寻找USP39的配体。一是利用热位移实验（Thermal Shift Assay， TSA）筛选一个包含约200个已知生物活性小分子的内部化合物库，该库源于团队先前关于细胞重编程的研究。二是进行DNA编码化合物库（DNA-encoded Library, DEL）筛选，该库包含约6亿个独特分子。DEL筛选将纯化的全长USP39（USP39_FL）蛋白固定在磁珠上，与文库孵育后，通过PCR扩增和下一代测序鉴定富集的结合物。两种方法共同指向了一类含有噻唑（thiazole）骨架的化合物，并从中选出了两个先导配体：USP39_B1和USP39_B2。TSA证实了这两种化合物能直接结合USP39_FL并降低其热稳定性。

2. 结合位点鉴定与配体优化 由于USP39的全长晶体结构尚未解析，研究团队使用AlphaFold3预测了其结构，显示其包含一个N端RS样结构域、一个中央锌指（Zinc-Finger， ZnF）结构域和一个C端USP结构域。分子对接预测USP39_B1主要与ZnF结构域相互作用。为了实验验证，他们纯化了USP39的截短体（包含ZnF和USP结构域的USP39_T1，以及仅含ZnF结构域的USP39_T2）。TSA和荧光偏振（Fluorescence Polarization， FP）实验均证实USP39_B1与这些截短体结合，支持了其与ZnF结构域互作的预测。

为了深入理解结合模式并指导优化，他们利用AlphaFold3进行分子对接研究，预测了关键相互作用残基（Phe120， Leu123， Tyr142）。通过定点突变构建了结合关键残基突变体（ZnF_M1）和空间临近但非关键残基的对照突变体（ZnF_M2）。实验表明，ZnF_M1完全丧失了与USP39_B1的结合能力，而ZnF_M2的结合能力与野生型相当，从而验证了预测的结合模型。

基于此模型，研究团队对配体进行了结构-活性关系（SAR）研究。他们系统地合成了苯环修饰的衍生物，发现将USP39_B1苯环上的氯原子替换为间位的氟（得到USP39_B3）或间位的氯，能显著提高结合亲和力。竞争性FP实验证实USP39_B3对USP39_T2的IC50达到1.18 µM，优于先导化合物。

3. PROTAC的设计、合成与体外表征 鉴于USP39_B1等配体仅通过表面相互作用结合，本身不引起明显的细胞表型，研究团队决定将其发展为PROTAC的“弹头”（Warhead）。他们选择了两种常用的E3连接酶配体：VHL（Von Hippel-Lindau）和CRBN（Cereblon）配体，并设计了多种不同连接链（Linker）的PROTAC分子（共20个VHL基和40个CRBN基）。通过标准的酰胺化反应合成了这些分子，其中代表性子USP39_PROTAC_V1采用了PEG3连接链以增强水溶性。

随后，他们通过一系列生物物理和生化实验评估了PROTAC的体外特性。AlphaLISA实验证实USP39_PROTAC_V1能有效介导USP39和VHL之间形成稳定的三元复合物（Kd = 232 nM），而其母体配体USP39_B1则不能。等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry， ITC）直接测定了USP39_PROTAC_V1与USP39_T2的结合亲和力（Kd = 136 nM）。竞争性FP实验进一步显示，含有优化配体（间位氯取代）的PROTAC变体（如USP39_PROTAC_V2）具有更强的结合力。此外，研究团队还利用SwissADME工具预测了PROTAC的物理化学和药代动力学性质，评估其细胞渗透性和代谢稳定性，为后续细胞实验筛选出USP39_PROTAC_V1作为先导候选分子。

4. 细胞水平USP39降解的验证与机制研究 研究团队在多种细胞系（HeLa， HEK293T， LNCaP， Kelly）中评估了PROTAC的降解效能。他们首先优化了基于HeLa细胞瞬时过表达USP39-OFP（橙色荧光蛋白融合）的荧光降解实验条件。筛选发现，VHL基的PROTAC（特别是USP39_PROTAC_V1）在细胞中表现出显著的降解活性，而大多数CRBN基的PROTAC效果不佳，这表明三元复合物形成的效率可能比预测的药代动力学参数更为关键。

剂量和时间效应实验表明，USP39_PROTAC_V1在低至1 nM浓度下处理24小时，或在5 nM浓度下处理6小时，即可有效启动USP39的降解。在高浓度（>500 nM）时观察到“钩状效应”（Hook effect），即降解效率下降，这是PROTAC的典型特征。为了评估选择性，研究团队进行了基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析。结果显示，在超过6000个可检测蛋白中，USP39是下调最显著的蛋白。除了USP39，只有NDRG1和ISG15两个与细胞周期和应激反应相关的蛋白显著下调，而同源的USP5和USP10则不受影响，证明了PROTAC_V1的高度选择性。

机制研究表明，USP39_PROTAC_V1诱导的降解是蛋白酶体依赖性的（可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断）和Neddylation依赖性的（可被Neddylation抑制剂MLN4924阻断）。在VHL敲除（KO）的HeLa细胞中，降解被显著削弱。同样，在表达缺乏羟基脯氨酸结合结构域的VHL截短突变体（VHL_M）的细胞中，降解效率大幅降低（DC50增加80倍以上）。荧光共振能量转移（FRET）实验和免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步在细胞水平证实了PROTAC_V1能诱导USP39、VHL和泛素之间形成功能性的三元复合物，并促进USP39的多聚泛素化。

5. 功能性后果验证 为了确认USP39降解能够复现已知的生物学效应，研究团队检测了特定基因（ZNF414和CRK）的剪接模式。之前的研究表明，USP39缺失会导致5‘剪接位点（5’-splice-site）选择异常，使这些基因更倾向于使用非典型的“隐秘”5‘剪接位点。RT-PCR分析显示，用10 nM USP39_PROTAC_V1处理细胞24小时后，确实再现了与USP39缺失相同的剪接模式改变（ZNF414的外显子1延长，CRK的外显子1缩短）。这一结果不仅验证了PROTAC降解USP39的功能有效性，也将其作用机制与特定的疾病相关通路（如癌症和视网膜色素变性）联系起来。

四、 主要研究结果 1. 成功发现了首个靶向USP39的小分子配体：通过TSA和DEL筛选，鉴定出以噻唑为核心骨架的USP39结合化合物（USP39_B1/B2）。实验证实它们主要与USP39的ZnF结构域结合，并通过AlphaFold3建模和点突变验证了关键结合残基（Phe120， Leu123， Tyr142）。通过SAR研究优化得到了亲和力更高的衍生物USP39_B3。 2. 设计并合成了高效、选择性的USP39靶向PROTAC：以优化的USP39配体为弹头，连接VHL或CRBN配体，合成了系列PROTAC。其中USP39_PROTAC_V1展现出优秀的体外三元复合物形成能力（AlphaLISA Kd = 232 nM）和与靶蛋白的直接结合力（ITC Kd = 136 nm）。 3. 在细胞模型中实现了纳摩尔级的高效、特异性降解：USP39_PROTAC_V1在多种细胞系中能实现低至1 nM浓度下的USP39降解。蛋白质组学分析表明其降解具有高度选择性，主要靶点为USP39本身。降解过程依赖于VHL E3连接酶的招募、蛋白的Neddylation激活以及蛋白酶体功能。 4. 机制上证实了PROTAC诱导的泛素化与降解途径：通过FRET、Co-IP等实验，在细胞水平直接观察并证实了PROTAC_V1介导的USP39-VHL-泛素三元复合物的形成，以及USP39的多聚泛素化。 5. 验证了降解的功能性后果和治疗相关性：USP39_PROTAC_V1处理细胞后，成功复现了之前报道的、由USP39缺失导致的特定5‘剪接位点选择异常。这证明该PROTAC策略不仅能降解靶蛋白，还能精确地模拟其功能缺失的表型，为干预剪接相关疾病通路（如癌症）提供了概念验证。

这些结果环环相扣：配体的发现是设计PROTAC的基础；体外表征验证了PROTAC分子的合理性和效力；细胞实验证明了其降解能力、选择性和机制；最终的功能性剪接分析将分子水平的降解与具有明确生物学意义的表型联系起来，完成了从靶点识别到功能验证的完整逻辑链条。

五、 研究结论与意义 本研究的核心结论是：首次成功开发了靶向“不可成药”剪接体蛋白USP39的PROTAC降解剂。该研究通过化学诱导邻近（Chemically Induced Proximity）的策略，利用中等亲和力的变构配体，有效地将USP39招募到E3泛素连接酶VHL附近，从而实现了对USP39的高效、选择性降解。

其科学价值在于： * 拓展了“不可成药”靶点的范围：为靶向缺乏酶活性口袋、传统上难以用抑制剂干预的支架蛋白或RNA结合蛋白提供了成功范例。 * 深化了对PROTAC作用机制的理解：研究表明，即使初始配体-靶蛋白相互作用的亲和力仅为微摩尔级别（而非传统药物研发所追求的高纳摩尔或皮摩尔级别），只要能有效诱导三元复合物形成，仍可实现高效的靶蛋白降解。这强调了在PROTAC设计中，结合动力学和诱导邻近的效能可能比绝对结合亲和力更为重要。 * 提供了一种研究剪接调控的新工具：所开发的USP39_PROTAC可作为化学探针，用于在时间和剂量可控的条件下，在多种细胞模型中研究USP39功能缺失的即时后果，有助于更精细地解析剪接体组装和功能的分子机制。

其应用潜力在于： * 开辟了治疗剪接相关疾病的新途径：USP39在多种癌症中过表达或发挥关键作用。本研究为开发基于USP39降解的新型抗癌疗法奠定了坚实的临床前基础。同时，由于USP39缺失与视网膜色素变性等疾病相关，该策略也可能具有更广泛的应用前景。 * 验证了PROTAC技术用于非经典靶点的可行性：进一步证实了PROTAC平台在攻克传统小分子药物难以触及的靶点方面的强大能力和通用性。

六、 研究亮点 1. 靶点新颖且挑战性高：首次针对无催化活性的剪接体核心组件USP39进行小分子靶向和降解剂开发，攻克了一个经典的“不可成药”靶点。 2. 方法学融合与创新：结合了传统TSA筛选、高通量DEL筛选、AI驱动的结构预测（AlphaFold3）、理性的SAR优化以及PROTAC设计，展现了一套现代药物发现的多平台整合策略。 3. 机制验证全面深入：从体外生物物理结合、三元复合物形成，到细胞内的降解动力学、选择性（蛋白质组学）、依赖性（蛋白酶体、Neddylation、特定E3连接酶），再到最终的功能性表型验证（剪接模式变化），对PROTAC的作用机制进行了多层次、全方位的严谨论证。 4. 概念突破性：明确展示了中等亲和力配体在PROTAC上下文中的有效性，挑战了传统药物发现中对高亲和力的绝对追求，突出了化学诱导邻近这一核心原理的威力。

七、 其他有价值内容 研究团队在讨论部分还提出了一个有趣的现象：他们的USP39配体结合导致蛋白热稳定性降低（负向热位移），这与结合通常稳定蛋白质的常见现象相反。他们将其归因于USP39缺乏传统的疏水结合口袋，配体结合可能扰动了一个稳定的表面环或改变了ZnF结构域的构象。这一观察加深了对非经典蛋白-配体相互作用的理解。

此外，研究提供了详尽的支撑信息，包括所有PROTAC的化学合成路线、化合物结构、NMR和质谱数据、详细的生物学实验方法以及蛋白质组学数据分析流程，为其他研究者复现和拓展这项工作提供了宝贵资源。所有质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟的PRIDE数据库（标识符PXD065738），体现了研究的可重复性和开放性。