本研究由清华大学、北京大学肿瘤医院、中国医学科学院北京协和医学院等多家机构的研究人员合作完成，主要通讯作者为古槿教授和熊卓教授。该研究成果于2024年发表在Nature Communications期刊上。
一、学术背景与研究目的
本研究属于癌症研究、组织工程与个性化医疗的交叉领域。肺癌是全球癌症死亡的主要原因，尽管靶向治疗和免疫治疗等策略不断涌现，但患者的治疗反应存在高度异质性，且完全缓解率低。研究界已普遍认识到，肿瘤异质性和肿瘤微环境在肿瘤发展和抗癌治疗疗效不佳中扮演着关键角色。TME包含细胞外基质以及包括免疫细胞和基质细胞在内的多种细胞成分，其中癌症相关成纤维细胞是TME中的主要基质细胞，能够驱动癌症转移和耐药，并调节免疫微环境。TME在患者之间以及同一患者肿瘤内部都存在巨大差异，这种异质性给精准治疗和药物开发带来了巨大挑战。
因此，在体外重建一个包含肿瘤异质性和个性化TME的癌症模型，已成为癌症研究和精准医疗中的一个关键问题。目前的体外癌症模型存在显著局限：传统的2D和3D球体培养模型缺乏亲代肿瘤的异质性细胞亚型和分子特征。患者来源的癌症类器官是目前能复制亲代肿瘤病理形态和部分遗传特征的“明星”模型，但基于基质胶的传统类器官模型主要代表肿瘤上皮成分，内源性基质和免疫细胞在培养过程中会逐渐丢失。虽然已有研究尝试通过气液界面培养法或将类器官与CAFs、免疫细胞共培养来重构部分TME，但这些方法在精确可控性、均一性和通量方面存在不足。此外，由切碎的肿瘤片段衍生的类器官虽能维持原生组织结构和TME成分，但手动组织切碎导致片段大小不可重现、环境不均一，且从微小肿瘤组织中获得的毫米级片段数量有限，限制了其在高通量药物筛选中的应用。
近年来，组装配体（Assembloids）——由多种细胞类型或类器官融合和功能整合形成的3D结构，被认为是理解人类发育和疾病的最新前沿工具。然而，目前的组装配体主要通过共培养或3D挤出打印方法制造，前者难以控制形态结构且批次内一致性差，后者在快速生成具有所需尺寸和精度的微米级组织模型方面能力有限。因此，快速制备具有良好批次内均一性的肿瘤组装配体仍然是一个巨大挑战。
基于此，本研究旨在开发一种创新的、患者特异性的肺癌组装配体模型，以克服现有模型的局限性。具体目标包括：1）利用微流控技术高通量、均一地制备包含患者来源TME细胞和肺癌类器官的组装配体；2）系统表征该模型在组织学、基因组、转录组和细胞异质性等方面对亲代肿瘤的复现能力；3）评估该模型在重现CAFs功能异性和药物反应方面的潜力；4）验证该模型预测患者临床治疗反应的能力，为其在基础研究和个性化药物筛选中的应用奠定基础。
二、研究流程与方法细节
本研究流程复杂且系统，主要包含以下几个关键环节：
1. 患者样本收集与细胞分离： 研究共收集了49例临床肿瘤样本。肿瘤组织一部分用于基因组和转录组测序，一部分固定用于组织病理学分析，其余部分用于分离细胞。通过酶消化法处理肿瘤组织，随后利用差速贴壁和沉降技术，从同一患者样本中并行分离培养三种关键细胞组分：肺癌类器官、癌症相关成纤维细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。成功从36名患者的样本中获得了这些肿瘤来源细胞，用于后续组装配体的构建。
2. LCA模型的构建——基于微注射策略的液滴微流控技术： 这是本研究的核心技术创新。研究团队开发了一个创新的微流控平台，其关键在于“微注射策略”。该平台主要包括生物墨水制备和LCA生成两个过程。 * 生物墨水制备： 将患者来源的LCOs和TME细胞均匀混合在一种优化的明胶甲基丙烯酰-基质胶复合水凝胶中。该水凝胶结合了GelMA的良好加工性、可调机械性能和生物相容性，以及基质胶能为患者来源类器官提供有利微环境的优点。经过优化，最终确定使用6% (w/v) GelMA与15% (v/v) Matrigel的复合配方，其压缩弹性模量与患者肺肿瘤组织相近。 * 微流控生成组装配体前体： 平台设计了一个微注射模块，用于精确操控微量样本。细胞负载的水凝胶被吸入一根硅胶管，并由空气与推进剂PBS隔开以防止稀释。硅胶管末端连接一个T型结芯片，在那里，细胞-水凝胶混合物被矿物油剪切形成单分散的液滴。通过优化水相和油相的流速，可以形成尺寸为400-500微米、封装有1500-2500个细胞的均一组装配体前体液滴。 * 交联与培养： 液滴随后通过405纳米紫外光进行光交联，形成稳定的、细胞负载的微凝胶（即LCA前体）。将这些前体收集并置于含特定培养基的超低吸附培养板中培养3天，细胞在水凝胶微球内自组织生长，最终形成成熟的肺癌组装配体。此方法成功率高达97.2%（35/36）。即使使用仅10微升、细胞密度高达10^8 cells/mL的微量样本（如穿刺活检所得），也能在1分钟内生成约200个均一的LCA，展示了其在处理临床微样本方面的巨大优势。
3. LCA模型的系统表征： * 组织学与免疫组化分析： 对LCA及其亲代肿瘤进行H&E染色和免疫荧光染色。结果显示，LCA复现了亲代肿瘤的异质性组织学特征，包括肿瘤细胞的分化程度、CK7和Ki67的异质性表达模式。同时，LCA内可观察到Epcam+肿瘤细胞、α-SMA+ CAFs和CD45+/CD3+免疫细胞的共存，表明其成功重建了包含多种TME成分的肿瘤微环境。 * 转录组与基因组分析： 对4名患者的肿瘤、癌旁正常组织及对应LCA进行批量RNA测序。转录组对比显示，LCA与亲代肿瘤具有高度相似性，整体相关系数达0.86。通路富集分析表明，LCA与肿瘤在细胞周期、增殖、上皮分化等通路上高度一致。对3名患者的样本进行全外显子组测序分析发现，LCA保留了亲代肿瘤中绝大多数体细胞突变和拷贝数变异，包括肺癌典型的TP53、TTN等基因突变。 * 单细胞RNA测序分析： 对2名患者的亲代肿瘤及培养1周、2周的对应LCA进行scRNA-seq。整合分析鉴定了上皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和巨噬细胞等主要细胞类型，并进一步细分了上皮细胞和成纤维细胞的亚群。分析表明，培养1周的LCA细胞类型比例与亲代肿瘤高度相似，且各细胞类型的转录组相似性很高。细胞间通讯分析显示，LCA维持了亲代肿瘤中主要的配体-受体相互作用，特别是与CAFs功能异质性相关的HGF-MET、FGF-FGFR等通路。
4. CAFs功能异质性研究： 利用建立的CAFs生物样本库，研究人员首先通过ELISA检测了7名患者来源CAFs的HGF和FGF7分泌水平，发现了功能异质性亚型（如HGF-high/FGF7-high和HGF-low/FGF7-low）。随后，将不同亚型的CAFs与对应患者的LCOs共同封装构建LCA，评估CAFs对肿瘤生长和药物反应的影响。研究发现，高分泌HGF/FGF7的CAFs能显著促进对应肿瘤细胞的生长，并提高LCA对化疗药物紫杉醇或靶向药奥希替尼的耐药性；而低分泌型CAFs则无此保护作用。联合使用CAFs靶向药物吡非尼酮，能有效逆转高活性CAFs介导的化疗耐药，但对低活性CAFs对应的LCA效果有限，从而在LCA模型中重建并识别了CAFs的功能异质性。
5. 个性化药物测试与临床验证： 这是评估LCA模型临床应用价值的关键步骤。 * 药物反应异质性与一致性评估： 对多名患者的LCA和LCO进行大规模细胞活力测试。结果显示，LCA和LCO都能复现患者间和患者内对化疗药物的反应异质性。但LCA对化疗和靶向药物的反应普遍低于LCO，这被认为是TME存在的真实反映。更重要的是，LCA组在平行实验孔间的细胞活力一致性显著优于LCO组，变异系数更低，重复实验间的相关性更高，表明LCA模型具有良好的重现性。 * 靶向治疗预测验证： 对9名患者（3名EGFR突变型，6名野生型）的LCA进行EGFR靶向药伏美替尼测试。药物反应曲线完美区分了突变型（敏感）和野生型（耐药）。进一步，对一名携带EGFR突变的患者（LC46），在其新辅助治疗前获取活检样本构建LCA，并按照临床方案（紫杉醇+卡铂+伏美替尼）进行药物测试。LCA测试结果显示三药联合方案最敏感，与患者临床治疗后的显著肿瘤缩小结果一致。 * 免疫联合治疗预测验证： 测试了LCA对PD-1抑制剂联合铂类双药化疗的反应。结果显示，PD-1+化疗能显著改善部分患者LCA的反应，与临床上该方案能提高可切除非小细胞肺癌患者无事件生存期的发现一致。例如，患者LC42的LCA对PD-1+紫杉醇/卡铂方案比单纯化疗更敏感，与其接受2周期该新辅助治疗后肿瘤显著缩小的临床结果相符。 * 临床结果对比： 综合7名有可用临床结果的患者数据，LCA模型预测的药物敏感性与其临床疗效（根据实体瘤疗效评价标准评估）达到了100%的一致性，展现了其精准预测的潜力。
三、主要研究结果
本研究的实验结果层层递进，系统证明了LCA模型的有效性和价值： 1. 技术可行性结果： 成功开发了基于微注射液滴微流控的LCA制备平台，能够高通量、高均一地生成患者特异性组装配体，并成功对LCA进行冷冻保存和复苏，为构建活体生物样本库奠定了基础。 2. 生物学保真度结果： 组织学、免疫组化、批量转录组/基因组测序及单细胞转录组测序等多层次证据共同表明，LCA能够复现亲代肿瘤的间质和瘤内异质性、TME细胞多样性、基因组和转录组景观以及细胞间相互作用特征。这些结果为LCA作为可靠的体外肿瘤模型提供了核心生物学依据。 3. 功能研究结果： 利用LCA模型，成功重现了CAFs的功能异质性，并证实了特定亚型CAFs在促进肿瘤生长和介导耐药中的作用。同时，模型能够评估靶向CAFs的联合治疗策略的有效性，为研究肿瘤-基质相互作用和开发联合疗法提供了新工具。 4. 临床应用潜力结果： 药物测试表明，LCA模型不仅具有良好的实验可重复性，还能准确区分基于基因型的靶向药物敏感性（如EGFR突变），并成功预测了患者对新辅助靶向治疗和免疫联合化疗的临床反应，预测准确率高达100%。这直接证明了LCA在个性化药物筛选和疗效预测中的巨大应用价值。
四、研究结论与意义
本研究成功开发并系统验证了一种创新的、患者特异性的肺癌组装配体模型。该模型通过微流控技术整合患者来源的肿瘤类器官和TME细胞，实现了高通量、均一化的构建，克服了传统类器官和组装配体模型的局限性。
科学价值： 1. 提供了一种先进的癌症研究模型： LCA模型在三维结构中同时保留了肿瘤细胞及其原生微环境，比传统类器官更全面地模拟了体内肿瘤的复杂性和异质性，为研究肿瘤发生发展、耐药机制、免疫逃逸等基础生物学问题提供了更优的工具。 2. 揭示了CAFs功能异质性的研究平台： 该模型为在患者特异性背景下研究CAFs的功能异质性及其对治疗反应的影响提供了有效手段，有助于深入理解肿瘤微环境在治疗抵抗中的作用。 3. 推动了组织工程与微流控技术在癌症建模中的应用： 本研究发展的微注射液滴微流控技术，为利用临床微量样本精准构建复杂的多细胞3D组织模型提供了可推广的方法学框架。
应用价值： 1. 个性化医疗的强力工具： LCA模型能够快速、准确地预测个体患者对多种治疗方案的响应，包括化疗、靶向治疗及免疫联合治疗，有望在未来指导临床医生为患者选择最有效的个性化治疗方案，实现真正的“精准医疗”。 2. 新药研发的临床前平台： 该模型可用于在更贴近人体肿瘤环境的条件下进行高通量药物筛选和药效评估，尤其是对涉及TME调节的联合疗法，有望提高新药研发的成功率和效率。 3. 构建“活体”生物样本库： LCA可冻存复苏的特性，使得建立包含患者肿瘤及其微环境的“活体”生物银行成为可能，这将极大地促进转化医学研究和回顾性临床研究。
五、研究亮点