该研究由哈佛医学院神经生物学系的 Mathew Tantama、Juan Ramón Martínez-François、Rebecca Mongeon 和 Gary Yellen 完成，并于 2013 年 10 月 7 日发表在 Nature Communications 上。细胞内的 ATP:ADP 比值是细胞能量状态的核心调控参数。它决定了 ATP 水解的自由能变化，进而影响许多生化反应的驱动方向和速率。该比值不仅反映细胞的健康状态，还通过别构调节机制控制多种代谢和信号通路。例如，AMP 激活蛋白激酶（AMPK）通过感知 ATP:ADP 变化来平衡分解与合成代谢；在神经元和神经内分泌细胞中，电活动与能量代谢紧密耦合，离子泵活动消耗 ATP 会导致 ATP:ADP 快速下降。
此前该团队曾开发出第一代 ATP:ADP 荧光生物传感器 Perceval，但其响应范围在 ATP:ADP 比值低于 5 时即饱和，而哺乳动物细胞在健康状态下 ATP:ADP 通常为 1 至大于 100，因此 Perceval 无法有效监测生理范围内的能量变化。本研究的核心目标是通过结构导向的蛋白质工程改造，开发一种响应范围更宽、动态范围更大的新型传感器 PercevalHR（Perceval High Range），并验证其在活细胞中实时监测 ATP:ADP 动态变化的能力。
研究首先进行了传感器蛋白的工程改造与体外表征。作者以原始 Perceval 传感器为基础，对其 ATP 结合口袋周围的氨基酸残基进行了密集的定点突变和易错 PCR 筛选。经过多轮筛选，获得了改进型变体 PercevalHR。体外实验表明，该传感器在 420 nm 和 500 nm 附近具有两个不同的激发峰，ATP 结合增强 500 nm 激发荧光，ADP 结合增强 420 nm 激发荧光，在 455 nm 处存在等吸收点。通过计算荧光比值可消除传感器表达量的影响。在 0.5 mM 游离镁离子条件下，PercevalHR 的半最大响应所对应的 ATP:ADP 比值约为 3.5，检测范围约从 0.4 到 40，远优于原始 Perceval 的约 0.5。解离动力学时间常数约为 1.5 至 2.1 秒，能够响应数秒内的生理变化。
为验证传感器在活细胞中的可靠性，作者在培养的小鼠胚胎皮层神经元中表达 PercevalHR，并使用鱼藤酮和寡霉素进行代谢抑制。结果显示传感器信号下降，随后通过标准的荧光素酶生化方法对同一批细胞提取物进行 ATP:ADP 测定，证实了成像信号与生化测量结果一致。传感器表达水平在十倍范围内变化时，信号变化幅度不变，说明 PercevalHR 不会缓冲 ATP 或 ADP。
随后，研究者在培养的星形胶质细胞中研究了细胞外葡萄糖浓度变化对 ATP:ADP 的影响。星形胶质细胞中共表达了红色 pH 生物传感器 pHRed，以校正 PercevalHR 的 pH 敏感性。实验观察到星形胶质细胞的 ATP:ADP 与葡萄糖供应紧密耦合，但单细胞之间对鱼藤酮和寡霉素的响应存在异质性。部分细胞仅对寡霉素有反应，提示不同星形胶质细胞依赖糖酵解或线粒体氧化磷酸化的程度不同。
在神经元能量消耗实验中，作者利用 PercevalHR 监测了三种不同刺激引起的活动依赖性 ATP:ADP 变化：50 μM 谷氨酸作用 6 秒、15 mM KCl 去极化 30 秒以及 20 Hz 场电刺激 250 次脉冲。结果显示谷氨酸刺激引起约 50% 的传感器占位下降，KCl 引起约 30%，场电刺激引起约 5%。同一实验条件下，培养的星形胶质细胞对相同刺激无明显响应。
为进一步建立 ATP:ADP 与电生理功能之间的直接联系，研究者在稳定表达 KATP 通道亚基 Kir6.2 和 SUR1 的 HEK293 细胞中共表达了 PercevalHR 和 pHRed，并在细胞贴附式膜片钳记录单通道电流的同时进行荧光成像。代谢抑制分别采用 2-脱氧葡萄糖替代葡萄糖或加入碘乙酸。在葡萄糖被 2-脱氧葡萄糖替换后，PercevalHR 信号逐渐下降，伴随 KATP 单通道开放概率逐渐升高。通道活性可被 200 nM 格列本脲抑制，证实了电流来源于 KATP 通道。碘乙酸引起更快的 ATP:ADP 下降和通道激活。统计六次细胞记录显示，当 ATP:ADP 仅降至约 5 至 10 时，KATP 通道开放概率即开始上升；在 ATP:ADP 为 1 至 4 时达到接近最大开放概率约 0.1。
最后，作者验证了 PercevalHR 在双光子激发下的性能。纯化的 PercevalHR 蛋白在 ATP 和 ADP 负载状态下表现出不同的双光子激发光谱。在共表达 PercevalHR 和 pHRed 的 HEK293 细胞中，作者使用 950 nm 和 840 nm 双光子激发进行比值成像，同时借助 pHRed 的荧光寿命信号监测细胞内 pH。碘乙酸处理后，PercevalHR 双光子比值信号明显下降，伴随细胞内缓慢酸化，与单光子成像结果一致。
PercevalHR 的体外剂量响应曲线显示其最大信号变化超过八倍，远优于原始 Perceval 的两倍。结合常数测定表明传感器对 MgATP 的表观亲和力约为 3.4 μM，对 ADP 的表观亲和力约为 1.1 μM，因此在生理浓度下传感器始终被 ATP 或 ADP 占据，荧光信号只反映两者的比值而非绝对浓度。特异性和干扰实验表明，α-酮戊二酸、AMP 或 GTP 不会显著干扰传感器的响应。
神经元代谢抑制实验中，PercevalHR 信号时间曲线表现为在加入鱼藤酮和寡霉素后数分钟内逐步下降并趋于稳定。荧光素酶生化测定显示代谢抑制组培养物的 ATP:ADP 显著低于对照组，且与成像数据变化方向一致。表达水平与信号变化之间不存在显著相关性，进一步支持传感器不缓冲核苷酸的结论。
星形胶质细胞实验中，在葡萄糖从 25 mM 降至 5 mM 时仅观察到轻微信号变化，降至 0.1 mM 时信号出现大幅且可逆的下降。pH 校正后的数据显示，部分星形胶质细胞在鱼藤酮处理时 ATP:ADP 未明显改变，但在寡霉素处理后下降；另一些细胞对两种抑制剂均敏感。所有细胞均出现酸化，但去除 pH 偏倚后，不同细胞的能量响应模式存在明显差异。
神经元刺激实验中，谷氨酸诱导的 ATP:ADP 下降幅度最大，恢复时间最长；KCl 诱导的下降幅度较小且恢复较快；场电刺激引起的下降幅度最小。来自独立培养的六次实验统计结果支持这一梯度响应模式。星形胶质细胞在相同条件下的无响应进一步说明神经元信号的细胞类型特异性。
KATP 单通道实验中，当 PercevalHR 占位降至约 0.8 以下，即 ATP:ADP 低于约 10 时，通道开放概率开始上升。在 ATP:ADP 约为 5 时开放概率已明显升高，而在 ATP:ADP 为 1 至 4 时接近饱和。这一相关性在 2-脱氧葡萄糖和碘乙酸处理中均成立，说明通道响应与 ATP:ADP 降低之间存在内在的偶联关系。
双光子成像数据表明，在 950 nm 与 840 nm 激发下，PercevalHR 的荧光比值在代谢抑制后显著下降，而 pHRed 的荧光寿命同步上升，反映酸化。pH 校正后的传感器占位曲线进一步消除了酸化造成的偏倚，明确显示 ATP:ADP 的真实下降。
本研究成功开发了优化的基因编码荧光生物传感器 PercevalHR，其 ATP:ADP 检测范围与哺乳动物细胞的生理范围高度匹配。与生化提取方法相比，PercevalHR 具有非破坏性、单细胞分辨率、秒级时间分辨率等优势。与 31P 核磁共振相比，它具备较高的灵敏度和空间分辨率。与荧光素酶成像相比，它不消耗 ATP，且具备比值成像的自归一化特性。
该研究还证明了 PercevalHR 与红色荧光蛋白传感器 pHRed 的光谱兼容性，可以通过双色成像实现逐细胞的 pH 校正，避免将 pH 变化误判为能量变化。这一方法学框架对多种 pH 敏感型生物传感器的应用具有普遍参考价值。
在神经科学领域，PercevalHR 使研究人员能够直接观察神经元活动引起的能量状态动态变化，为理解神经元与星形胶质细胞之间的代谢耦合、神经退行性疾病中的能量代谢障碍以及神经兴奋性调控提供了有力工具。在 KATP 通道生理学方面，该研究首次在完整细胞内同时实时测量 ATP:ADP 和单通道活动，揭示了通道在 ATP:ADP 仍处于较高水平时即开始激活，提示质膜 PIP2 或局部 ADP 生成等机制可能参与其中。这一发现为深入研究 KATP 通道的生理调控打开了新的方向。
本研究的突出之处在于通过蛋白质工程实现了传感器检测范围的定向调谐，同时显著增大了动态范围。另一亮点是实现了成像与电生理的同步记录，将代谢状态与离子通道功能直接关联起来，这是传统方法难以实现的。此外，双光子成像的成功验证扩展了该传感器在组织切片和活体成像中的应用前景。
作者还指出，PercevalHR 报告的是 ATP 与 ADP 的比值而非绝对 ATP 浓度。这与已有的 ATP 浓度传感器 ATeam 互补。ATeam 可以监测总 ATP 水平变化，而 PercevalHR 则独立反映 ATP:ADP 比值。由于 ATP:ADP 决定热力学驱动力，而 ATP 总量与反应速率和转化能力相关，未来同时使用两种传感器将有助于解析腺嘌呤核苷酸代谢的不同维度，揭示细胞代谢调控中尚未被充分理解的能量信号机制。