主要作者与研究机构
本文的主要通讯作者为Saul J. Priceman，来自南加州大学凯克医学院（Keck School of Medicine of USC）医学肿瘤学系及KSOM/Norris癌症细胞免疫治疗研究中心。第一作者为Lupita S. Lopez，其所属机构包括南加州大学凯克医学院、希望之城（City of Hope）贝克曼研究所Irell and Manella生物科学研究生院以及希望之城血液学与造血细胞移植系。其他作者分别来自希望之城和Eureka Therapeutics公司。该研究发表于《Molecular Therapy: Advances》期刊2026年6月第34卷。
研究背景
转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC）是前列腺癌中极具挑战性的阶段，五年生存率仅约30%，有效治疗手段有限。尽管免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）在部分实体瘤和血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在mCRPC中未显示出类似的治疗应答。因此，双特异性T细胞衔接器（bispecific T cell engagers, BiTEs）和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞疗法成为临床研究的活跃领域。
前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）是mCRPC中极具吸引力的治疗靶点。尽管PSMA在部分正常组织（唾液腺、十二指肠黏膜、近端肾小管和脑）有低水平表达，但其在晚期前列腺癌中的过表达使其成为治疗干预的优选靶标。目前已有多个靶向PSMA的CAR-T细胞和BiTEs的临床研究报道，但均面临严重不良事件的挑战。例如，以人源化鼠源单克隆抗体J591的单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）作为抗原结合域的CAR-T细胞疗法显示了有前景的抗肿瘤活性，但也伴随巨噬细胞激活综合征（macrophage activation syndrome）和其他非预期毒性，这凸显了对更特异、人源化抗原结合子和优化构建体设计的需求。
本研究的核心目标是：利用人源scFv降低抗CAR免疫原性，通过优化CAR的胞外间隔区和跨膜区提高对PSMA的选择性靶向，并引入膜结合型IL-12（membrane-bound IL-12, mbIL12）分子以增强CAR-T细胞的抗肿瘤效力，最终开发出一种安全且有效的治疗PSMA阳性晚期前列腺癌的CAR-T细胞疗法。
研究流程与实验设计
本研究的工作流程可分为七个主要实验阶段：
第一阶段：人源PSMA-CAR-T细胞的开发。 研究者利用Eureka Therapeutics的E-alpha噬菌体展示文库筛选人源抗PSMA scFv。经过三轮淘选，从1080个克隆中获得两个独特克隆ET260-1和ET260-2。将这两个scFv分别克隆入含有CH3-IgG胞外间隔区（CH2缺失，称为dCH2）、CD4跨膜域（CD4tm）、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域的CAR构建体中，并以截短CD19（CD19t）作为标记基因。J591 scFv被克隆入相同构建体作为参照。研究人员使用过表达不同水平PSMA的PC-3细胞系在72小时共培养实验中评估了这些CAR-T细胞的杀伤功能、活化和IFN-γ分泌能力。
第二阶段：胞外间隔区与跨膜域的优化。 基于ET260-1 scFv，研究者构建了三种不同长度的胞外间隔区（dCH2、CD8h、HL）和三种不同跨膜域（CD4tm、CD8tm、CD28tm）共九种组合的CAR变体，系统评估了这些结构变化对CAR表达、肿瘤杀伤、T细胞活化和IFN-γ分泌的影响，优选出dCH2(CD28tm)BBz组合。
第三阶段：scFv亲和力成熟。 由于ET260-1 scFv的亲和力低于J591，研究者采用易错PCR（error-prone PCR）构建亲和力成熟文库，筛选出10个独特突变克隆。通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）测定各克隆与PSMA胞外域的结合动力学参数，选出5个亲和力提高且动力学特征接近J591的克隆，构建CAR-T细胞并进行功能和稳定性评估。
第四阶段：膜结合IL-12的工程化改造。 研究者将mbIL12分子与hPSMA-CAR共转导至T细胞，评估mbIL12对CAR-T细胞杀伤功能、活化标志物（4-1BB、CD25）表达、IFN-γ分泌、长期杀伤和增殖能力的挽救效应。同时通过IFN-γ受体阻断实验验证mbIL12的功能是否依赖IFN-γ信号通路。
第五阶段：体外巨噬细胞共培养安全性评估。 利用先前建立的体外系统，将CAR-T细胞与M1型或M2型极化巨噬细胞及PC-3肿瘤细胞共培养，比较不同CAR-T细胞在CD25活化、IL-6和IFN-γ分泌方面的差异，以评估潜在的细胞因子释放综合征和巨噬细胞激活综合征风险。
第六阶段：体内骨转移前列腺癌模型疗效评估。 采用胫骨内注射C4-2-ffluc细胞建立骨转移模型，以单次静脉注射CAR-T细胞治疗，通过生物发光成像监测肿瘤负荷，比较各组生存率和T细胞外周血持续性，并利用患者来源异种移植模型LAPC-9进行验证。
第七阶段：数据统计与分析。 数据以均值±标准误（SEM）表示，组间比较采用非配对双尾Student’s t检验。
主要研究结果
在人源PSMA-CAR-T细胞开发阶段，ET260-1和ET260-2 CAR-T细胞均能特异性杀伤PSMA阳性细胞，对PSMA阴性细胞活性有限。与ET260-2相比，ET260-1 CAR表现出更强的肿瘤杀伤、活化和IFN-γ分泌能力。值得关注的是，相比hPSMA-CAR-T细胞，J591-CAR-T细胞对PSMA低表达的PC-3野生型（WT）细胞表现出显著的非特异性杀伤和活化，提示J591-CAR可能存在更高的在靶脱瘤毒性风险。因此，ET260-1被选为先导scFv进行后续优化。
在胞外间隔区与跨膜域优化阶段，含有dCH2(CD28tm)的ET260-1 CAR-T细胞表现出更高的CAR表面表达、4-1BB表达和IFN-γ分泌，对PSMA中等和高表达细胞系的杀伤能力与J591-CAR相当，但对PC-3 WT细胞的非特异性活性显著低于J591-CAR。然而，在8天长期杀伤实验中，dCH2(CD28tm)构建体仍显示次优的肿瘤杀伤和T细胞扩增能力。
在亲和力成熟阶段，五个AM克隆中有两个（克隆56和69）表现出不稳定的CAR表达，克隆39出现双群体表达。克隆58在功能和表达稳定性上与亲本scFv最为接近。尽管SPR分析显示AM克隆的解离常数（KD）较亲本提高了约5-10倍，但CAR-T细胞功能并未显著改善，提示在CAR-T细胞背景下，单纯提高scFv亲和力并不能直接转化为更优的抗肿瘤活性，反而可能增加非特异性靶向风险。
在mbIL12工程化改造阶段，mbIL12的引入将hPSMA-CAR-T细胞的IFN-γ分泌提升至与J591-CAR相当的水平，同时显著增强了CD25活化表达和长期杀伤能力，且未增加对PC-3 WT细胞的非特异性杀伤。IFN-γ受体阻断实验揭示J591-CAR-T细胞的杀伤活性高度依赖IFN-γ信号，而hPSMA-CAR/mbIL12 T细胞的杀伤仅部分依赖IFN-γ信号，表明IL-12信号存在IFN-γ非依赖的功能机制。在递归肿瘤细胞再挑战实验中，ET260-1-CAR/mbIL12 T细胞展现出优于ET260-1-CAR和J591-CAR的持久杀伤能力、T细胞扩增和IFN-γ分泌水平。
在巨噬细胞共培养模型中，hPSMA-CAR/mbIL12 T细胞在M1和M2巨噬细胞存在下表现出显著升高的CD25活化，但IL-6分泌并未相应增加。相比之下，J591-CAR-T细胞在肿瘤细胞单独存在及M2巨噬细胞条件下均表现出显著更高的CD25表达和IL-6分泌。这一结果表明hPSMA-CAR/mbIL12 T细胞在保持激活和IFN-γ生产改善的同时，可能具有更优的细胞因子安全谱。
在体内骨转移模型中，ET260-1-CAR/mbIL12 T细胞治疗实现了100%完全应答率（6/6小鼠），优于J591-CAR的5/6完全应答和ET260-1-CAR的50%完全应答。此外，ET260-1/mbIL12 T细胞在外周血中显示出更强的持续性。在LAPC-9骨转移模型中，ET260-1-CAR/mbIL12治疗组的生存率同样优于ET260-1-CAR组。
研究结论与意义
本研究系统优化了一种基于人源scFv的PSMA靶向CAR-T细胞疗法，并通过膜结合IL-12工程化改造成功挽救了其抗肿瘤效力，同时保持了高度的靶点选择性。该策略的科学价值在于：首先，证明了人源scFv可有效降低抗CAR免疫原性风险，规避人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA）反应导致的CAR-T细胞清除和过敏反应；其次，揭示CAR-T细胞功能与scFv亲和力并非简单的正相关关系，过度提高亲和力可能诱发对低抗原表达正常组织的毒性；再次，证明了mbIL12通过部分IFN-γ非依赖途径增强CAR-T细胞功能，拓宽了对IL-12信号机制的理解。
在应用价值层面，该研究为mCRPC提供了一种潜在的安全有效的CAR-T细胞治疗候选方案。与临床中已报道的PSMA靶向策略相比，hPSMA-CAR/mbIL12 T细胞在体内模型中展现出更优的完全应答率和持久性，且体外安全性评估支持其较低的细胞因子毒性风险。此外，该设计理念——通过人源化抗原结合子降低免疫原性、通过结构优化提高选择性、通过膜结合细胞因子增强效力——对其他实体瘤CAR-T疗法的开发具有广泛的借鉴意义。
研究亮点
本研究的主要亮点包括：第一，首次采用全人源scFv（ET260-1）构建PSMA靶向CAR，显著降低免疫原性风险；第二，系统地优化了CAR胞外间隔区和跨膜域组合，确定dCH2(CD28tm)为最佳配置；第三，创新性地将膜结合型IL-12引入hPSMA-CAR-T细胞，在保持靶点特异性的前提下完全恢复了抗肿瘤效力；第四，通过IFN-γ受体阻断实验揭示了mbIL12的非经典作用机制；第五，通过体外巨噬细胞共培养模型和两种临床相关的骨转移前列腺癌体内模型，系统验证了该疗法的安全性潜力和治疗有效性。此外，研究还发现高亲和力scFv并非CAR-T细胞功能最优化的必要条件，这一发现对CAR设计理论具有重要的方法学贡献。