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主要作者与机构及发表信息
本研究的主要作者包括Chuang Jiang、Maoxiang Qian、Yoshihiro Gocho、Hui Zhang和Jun J. Yang，他们分别来自上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液肿瘤科、圣裘德儿童研究医院药物科学系、广州再生医学与健康广东实验室以及复旦大学附属儿科医院。该研究于2022年4月26日发表在《Blood Advances》期刊上。
学术背景
急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）是儿童中最常见的恶性疾病之一。尽管近年来ALL的治疗取得了显著进展，但部分患者因药物耐药性而复发，预后较差。表观遗传学改变（如组蛋白乙酰化）在造血细胞的恶性转化、疾病进展以及化疗耐药性的出现中起着重要作用。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC inhibitors, HDACi）如Panobinostat已被批准用于多发性骨髓瘤的治疗，并在ALL中显示出良好的抗白血病效果。然而，ALL中Panobinostat耐药的具体机制尚不清楚。本研究旨在通过全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，揭示Panobinostat耐药的关键分子机制，为克服耐药性提供新策略。
研究流程
本研究主要包括以下步骤：
全基因组CRISPR/Cas9筛选
研究人员使用GeCKO v2文库对Nalm6-Cas9细胞进行了全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。将Nalm6-Cas9细胞以0.3的感染复数（MOI）转导GeCKO v2文库，并在含有2 mg/mL嘌呤霉素的培养基中选择3天以确保基因编辑的完成。随后，将细胞分为两组，分别用DMSO或10 nM Panobinostat处理14天。在此期间，每7天收集一次样本并提取基因组DNA，进行sgRNA序列扩增和测序。利用MAGeCK算法分析sgRNA的相对富集情况，识别出显著影响Panobinostat敏感性的基因。
验证筛选结果
研究人员选择了排名靠前的6个显著富集基因（CREBBP、BAK1、SIRT1、KAT7、PMAIP1和ACLY）进行功能验证。通过构建sgRNA载体干扰这些基因的表达，并利用MTT实验检测细胞对Panobinostat的敏感性变化。
线粒体活性相关实验
为了进一步研究线粒体活性与Panobinostat耐药的关系，研究人员使用Rosiglitazone（一种PPARγ激活剂）刺激线粒体生物合成，并结合Panobinostat处理细胞。通过DCFH-DA染色检测活性氧（ROS）水平，通过TMRM染色检测线粒体膜电位（MMP），并通过Annexin V染色检测细胞凋亡率。此外，还对其他ALL细胞系（如REH和SEM）进行了类似的实验以验证结果的普适性。
SIRT1的功能研究
SIRT1被确定为CRISPR/Cas9筛选中的关键基因之一。研究人员通过RNA-seq分析了SIRT1过表达或敲低对基因表达谱的影响，并利用GSEA分析线粒体相关通路的变化。此外，通过Western blot和实时定量PCR检测了SIRT1对线粒体凋亡通路关键基因（如PMAIP1）的调控作用。
数据分析
数据分析包括差异基因表达分析、KEGG通路富集分析、GO生物过程分析以及基因集富集分析（GSEA）。所有数据均通过DESeq2、ClusterProfiler和Enrichr等工具进行处理。
主要结果
1. CRISPR/Cas9筛选结果
CRISPR/Cas9筛选发现多个与Panobinostat耐药相关的基因，其中线粒体相关通路（如氧化磷酸化、柠檬酸循环）显著富集。这表明线粒体功能缺陷可能是Panobinostat耐药的重要机制。
线粒体活性与Panobinostat耐药的关系
RNA-seq分析显示，Panobinostat处理显著降低了线粒体活性相关基因（如OXPHOS、丙酮酸代谢和TCA循环）的表达。此外，Panobinostat处理导致线粒体膜电位和ROS水平下降，进一步证实了线粒体活性的抑制。
Rosiglitazone增强线粒体活性的作用
Rosiglitazone能够显著提高线粒体膜电位和ROS水平，并与Panobinostat协同作用，显著增加细胞凋亡率。这一结果在多种ALL细胞系中得到了验证，表明增强线粒体活性可以克服Panobinostat耐药。
SIRT1调控Panobinostat敏感性的机制
SIRT1过表达显著增强了线粒体活性，并通过上调PMAIP1的表达激活线粒体凋亡通路，从而增加细胞对Panobinostat的敏感性。相反，SIRT1敲低则导致Panobinostat耐药。此外，跨癌种的关联分析显示，SIRT1表达水平与Panobinostat敏感性呈显著负相关。
结论与意义
本研究揭示了线粒体活性在Panobinostat耐药中的关键作用，并提出了通过增强线粒体活性来克服耐药的新策略。SIRT1作为线粒体功能的重要调节因子，其表达水平可作为预测Panobinostat疗效的潜在生物标志物。此外，SIRT1激活剂可能成为增强Panobinostat疗效的有效辅助治疗手段。这些发现不仅深化了我们对Panobinostat作用机制的理解，还为ALL及其他癌症的个性化治疗提供了新的思路。
研究亮点
1. 首次通过全基因组CRISPR/Cas9筛选揭示了线粒体活性在Panobinostat耐药中的核心作用。
2. 发现SIRT1通过调控线粒体功能影响Panobinostat敏感性，提出了一种全新的分子机制。
3. 提供了增强线粒体活性（如使用Rosiglitazone）作为克服Panobinostat耐药的潜在策略。
4. 跨癌种数据分析支持SIRT1作为预测Panobinostat疗效的通用生物标志物。
其他有价值内容
研究还探讨了不同ALL亚型中SIRT1表达的差异，发现MEF2D重排、ZNF重排和混合谱系白血病（MLL）重排的患者表现出较高的SIRT1表达，提示这些亚型可能对Panobinostat更敏感。这一发现为未来临床试验的设计提供了重要参考。