本研究由山西大学分子科学研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室的Yongkang Yue、Jiahong Ai、Hu Shi、Shuo Wang、Zhou Xu、Fangjun Huo、Caixia Yin，以及山西大学化学化工学院的Hu Shi、Shuo Wang，山西大学中医药现代研究中心Zhou Xu，临汾市第二人民医院Xiaojun Chai，山西大学应用化学研究所Fangjun Huo等共同完成。通讯作者为Yongkang Yue和Caixia Yin。该研究于2024年8月30日发表在美国化学会期刊《Analytical Chemistry》第96卷第14853至14859页，论文标题为《Fluorimetric tool to discriminate glomerular and tubular injuries in vivo》。
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种以肾功能快速下降为特征的临床综合征，全球每年约有1330万患者受累，其中170万人因相关原因死亡。AKI的病因和病理机制复杂，可依据病因分为肾前性、肾性和肾后性三类，不同类型的AKI在功能和器质性损伤方面表现各异。目前临床诊断AKI主要依赖肾小球滤过率评估，以血尿素氮和血清肌酐为指标，但这些指标缺乏特异性且反应迟缓，往往在肾小球滤过率损失超过50%时才能检出异常。近年来，基于荧光探针的成像方法被用于检测与AKI相关的凋亡和炎症因子，如caspase-3、caspase-8和超氧阴离子等。这类探针通常经过菊粉、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮等聚合物修饰，具有4至5.5纳米的粒径和约5200道尔顿的分子量范围，被称为肾脏可清除光学制剂（renal-clearable optical agents，RCOAs）。然而，活性氧和炎症介质在几乎所有AKI病例中普遍存在，现有的响应性探针难以区分不同类型的肾脏损伤。除肾活检外，现有技术很难直接评估肾脏损伤的具体类型。因此，本研究旨在开发一种能够通过荧光成像方法在活体水平区分肾小球损伤和肾小管损伤的新工具。
本研究以课题组此前报道的不对称七甲川菁染料CY-MU-7为核心探针。该染料在磷酸盐缓冲液中发射近红外荧光，并能与血清白蛋白自发结合形成复合物，使其荧光强度提高约8倍，发射波长从800纳米蓝移至755纳米。尽管两者荧光光谱存在严重重叠，无法通过基于荧光强度的检测区分游离染料和白蛋白结合态，但研究团队利用荧光寿命成像成功区分了不同器官中染料的发光形式。通过分子对接和分子动力学模拟，研究确定了CY-MU-7与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的两种主要结合模式，其中结合自由能更低的sys528模式表现出更强的相互作用。结合自由能分解计算表明，T491、F492、I498、M533和A537等低极性和疏水性残基在CY-MU-7与HSA的结合中起关键作用。不同溶剂中的荧光寿命测试显示，CY-MU-7的荧光寿命主要受溶剂极性影响，同时羟基振动也发挥一定作用，这提示荧光寿命可作为区分器官中游离染料和染料-白蛋白复合物的环境敏感指标。
在活体成像实验中，研究人员分别向ICR小鼠静脉注射CY-MU-7和预先结合HSA的CY-MU-7-HSA复合物，然后获取肝脏和肾脏的荧光寿命图像。结果显示，两种注射形式在肝脏中的荧光寿命基本一致，说明肝脏中染料主要以结合白蛋白的形式存在。而在肾脏中，注射CY-MU-7-HSA复合物仅呈现长寿命分布，注射游离CY-MU-7则同时出现短寿命和长寿命两种分布。短寿命分布对应肾脏对游离染料的高效捕获，长寿命分布则来自染料与小鼠血清白蛋白的部分结合。组织切片荧光成像进一步表明，无论注射何种形式，荧光信号均定位于肾小管细胞质和肾小球囊，而肝脏中的荧光分布均匀。这一结果说明CY-MU-7并非通过传统的肾脏清除途径标记肾脏，而是通过肾小管的重吸收作用进行标记。由于CY-MU-7的荧光强度与白蛋白浓度相关，这种标记机制使其能够反映肾小球损伤导致的蛋白通透性改变和肾小管损伤导致的重吸收效率变化。
研究者在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UTO）模型中首次验证了CY-MU-7-HSA监测肾功能的能力。UTO模型通过结扎一侧输尿管建立，可导致肾小管萎缩、间质纤维化和炎症等肾脏损伤。成像结果显示，健康侧右肾在静脉注射复合物后1分钟内即出现明亮荧光，而结扎侧左肾荧光信号明显模糊。通过计算左右肾荧光强度比值，研究者在梗阻后12小时即检测到显著差异，这一检测窗口早于文献报道的基于活性氧探针的24小时。组织病理学分析显示，梗阻2天后左肾尚未出现器质性损伤，但荧光比值已发生改变；梗阻5天后，左肾出现肾小管上皮细胞部分脱落、肾间质水肿和炎症浸润，荧光比值进一步降低。这一结果证实了CY-MU-7-HSA在UTO早期诊断中的高灵敏度。
在更关键的AKI分类实验中，研究者分别建立了膜性肾病（membranous nephropathy，MN）模型和顺铂诱导的肾小管损伤模型。膜性肾病模型通过阳离子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，cBSA）免疫小鼠建立，其病理特征为免疫复合物沿肾小球基底膜沉积，导致基底膜弥漫性增厚和蛋白通透性增加。顺铂模型通过腹腔注射20 mg/kg顺铂建立，其主要损伤部位为近端肾小管上皮细胞，机制涉及凋亡、自噬、细胞周期阻滞和线粒体功能障碍。成像结果显示，与健康对照组相比，膜性肾病组肾脏荧光信号增强，而顺铂诱导的肾小管损伤组荧光信号减弱。统计学分析证实膜性肾病组与对照组的差异具有高度显著性（p<0.01），顺铂组的差异具有显著性（p<0.05）。顺铂组小鼠在染料注射后尿液中荧光增强，进一步证实肾脏荧光降低源于肾小管重吸收功能不足。离体器官成像在染料注射4天后进行，所有荧光信号仍主要分布于肾脏，且成像对比度高于活体成像结果，表明CY-MU-7-HSA具有长时程肾脏标记特性，可消除检测时间对结果的影响。组织病理学分析确认了两个模型分别存在肾小球损伤和肾小管损伤。
本研究的主要结论是：CY-MU-7-HSA作为一种白蛋白浓度依赖性肾小管标记荧光复合物，能够在活体水平同时评价肾小球滤过和肾小管重吸收功能变化，首次通过荧光成像方法实现了肾小球损伤和肾小管损伤的区分。与传统的肾脏可清除光学制剂相比，CY-MU-7-HSA的标记机制基于肾小管对白蛋白-染料复合物的重吸收，因此肾小球损伤导致的蛋白通透性增高会使肾小管中可重吸收的荧光复合物增多，表现为肾脏荧光增强；而肾小管损伤导致的重吸收效率降低则使肾脏荧光减弱。这一反向变化的荧光信号为AKI的无创分型提供了理论基础。
该研究的科学价值主要体现在三方面。第一，首次利用荧光寿命成像阐明了CY-MU-7在体内的发光形式和器官标记机制，解决了传统荧光强度成像无法区分游离染料与白蛋白结合态的技术难题。第二，提出了以白蛋白通透性和重吸收效率作为肾小球损伤与肾小管损伤的病理学判别依据，为AKI的无创诊断和分型提供了新的策略。第三，在活体水平实现了膜性肾病和顺铂诱导肾小管损伤的荧光成像区分，并展示了12小时内检测尿道梗阻的能力，显著优于已有方法。该工作为AKI的早期精准诊断和个体化治疗提供了高效的成像工具，也为其他荧光染料和探针的活体形态学评价开辟了新思路。