针对核酸纯化的氧化还原响应性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及其回收效率提升的研究报告

一、 研究团队与发表信息 本项研究的主要作者包括Jiarui Li、Ziwei Shi、Xiuji Du、Guizhi Dong、Yufan Pan、Ruofan Chen、Miaomiao Qiu、Yun Xu、Lijin Xu*、Dongsheng Liu和Yuanchen Dong*。其中，通讯作者为中国人民大学的Lijin Xu和中国科学院化学研究所的Yuanchen Dong。研究合作单位还包括清华大学和香港理工大学。该研究成果以论文形式发表于ACS出版社的期刊《ACS Applied Polymer Materials》2025年第7卷，具体出版日期为2025年11月13日。

二、 学术背景与研究目标 本研究属于生物材料与生物分析化学交叉领域，具体聚焦于生物大分子分离纯化技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是生命科学研究中用于分析、分离核酸和蛋白质等生物大分子的核心技术之一，以其高分辨率、可靠性和通用性而著称。然而，传统PAGE在用于生物大分子的制备性纯化时面临一个长期存在的瓶颈：回收效率低下。这主要归因于传统凝胶高度交联的致密网络结构，该结构在电泳后会将目标分子物理性“捕获”或“包裹”在凝胶基质中，限制其扩散，导致从切下的凝胶块中回收目标分子的得率很低。尽管已有研究探索了使用多糖、聚乙二醇等替代基质，但这些材料往往在热稳定性、光学透明度或分离分辨率方面存在不足。

早在1976年，Hansen等人就提出了使用二硫键交联的聚丙烯酰胺凝胶，通过还原剂切断二硫键使整个凝胶网络解离，从而释放包埋的分子。但该方法需要额外的色谱步骤去除残留聚合物，且可能引入硫醇或磷酸盐等副产物，流程复杂。基于此背景，本研究团队旨在开发一种改进的策略，以克服传统PAGE回收率低的缺点，同时保持其高分离分辨率的优势。具体研究目标是：设计并合成一种新型的氧化还原响应性聚丙烯酰胺凝胶，通过引入可断裂的二硫键交联剂，使凝胶在完成电泳分离后，能在外加还原剂触发下发生可控溶胀（而非完全溶解），从而高效释放被包埋的核酸等生物大分子，显著提高回收效率，并尽量减少残留聚合物污染，为生物大分子的收集提供一种互补性方法。

三、 详细研究流程与方法 本研究包含从材料设计、合成、表征到生物应用验证的完整工作流程，具体步骤如下：

1. 响应性凝胶的设计与合成：

   • 研究材料：设计并合成了关键组分——可裂解交联剂N,N’-双丙烯酰胱氨酸（N,N′-bisacryloylcystine, BISS）。该分子结构与传统交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（methylenebis(acrylamide), MBA）相似，但含有关键的二硫键（-S-S-）。
   • 实验方法：以L-胱氨酸和丙烯酰氯为原料，在碱性甲醇溶液中合成BISS，并通过核磁共振氢谱验证其结构与纯度。随后，制备了一系列具有不同BISS与MBA摩尔比的双交联水凝胶，命名为PABxMy（其中x和y代表BISS与MBA的摩尔比）。例如，PAB32M1表示BISS与MBA的摩尔比为32:1。作为对照，合成了完全用BISS替代MBA的完全响应性凝胶（PAB1M0）以及传统的PAGE凝胶（仅含MBA）。所有凝胶的单体（丙烯酰胺）与总交联剂（BISS+MBA）的重量比固定为18:2，总水凝胶浓度为10%（w/v），通过自由基聚合引发形成。

2. 凝胶理化性质表征：

   • 力学性能测试：使用旋转流变仪测量了不同组成凝胶的储能模量（G’），评估其刚性。特别对比了凝胶在未经处理和处理还原剂三(2-羧乙基)膦（tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP）后的模量变化。此外，通过万能试验机对优选凝胶配方（PAB32M1）和传统PAGE进行了单轴拉伸测试，以评估其延展性。
   • 溶胀行为研究：将不同配方的水凝胶浸泡在去离子水或1 M TCEP还原剂溶液中，定期称重并观察其尺寸变化，定量和定性地评估凝胶的溶胀行为及其对还原条件的响应性。
   • 分子扩散评估：
     • 染料释放实验：将溴酚蓝和二甲苯青染料预先掺入凝胶中，观察在TCEP溶液中浸泡1小时后染料从凝胶中扩散出来的视觉变化，直观比较传统PAGE与PAB32M1凝胶的分子释放能力。
     • 扩散系数测定：将含有溴酚蓝的凝胶块浸入TCEP溶液，定期取样测量上清液在590 nm处的吸光度，通过释放动力学曲线计算溴酚蓝在不同凝胶中的扩散系数，进行定量比较。
   • DNA释放动力学：将固定量的15个核苷酸的单链DNA（ssDNA）预先包埋于PAB32M1和传统PAGE凝胶中，然后将凝胶浸入含有1 M TCEP的磷酸盐缓冲液中，并在65°C下孵育。在不同时间点取样，使用Nanodrop分光光度计直接测量上清液中的DNA浓度，绘制释放曲线，比较两种凝胶的DNA释放效率。

3. 电泳分离与纯化应用验证：

   • DNA的分离与回收：
     • 分离性能验证：使用变性（含6M尿素）和天然的PAB32M1凝胶，分别对一系列不同长度（15-40个核苷酸或碱基对）的单链及双链DNA进行电泳分离。使用GelRed染色并在紫外灯下观察条带，与传统PAGE的分离效果进行对比，评估分辨率是否受影响。
     • 回收效率量化：将已知量的DNA样品在PAB32M1和传统PAGE凝胶中进行电泳。在紫外灯下切取目标条带对应的凝胶块，将其切碎后，在含有TCEP的洗脱缓冲液中于65°C孵育1小时，触发凝胶溶胀和DNA释放。随后通过离心去除凝胶碎片，上清液用乙醇沉淀法回收DNA。最后，通过测量回收DNA的量，计算并比较两种凝胶对不同长度DNA片段的回收率（回收率 = 回收DNA量 / 上清初始DNA量）。所有实验均设置三个独立重复。
   • RNA的分离与回收：采用与DNA类似的流程，在RNase-free条件下，使用变性PAB32M1凝胶分离不同长度的单链RNA。回收过程在室温下进行以减少RNA降解，并比较了PAB32M1与传统PAGE对RNA的回收效率。
   • 蛋白质的分离与释放潜力验证：
     • 分离性能：以绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）为模型蛋白，在变性和非变性条件下，使用PAB32M1凝胶进行电泳分离，通过考马斯亮蓝染色或直接荧光成像观察分离效果。
     • 释放演示：将GFP包埋于PAB32M1凝胶中，然后在TCEP溶液中孵育，通过观察凝胶内及周围溶液中GFP荧光的变化，直观演示蛋白质从凝胶网络中的释放过程。并通过荧光分光光度计定量测定了GFP的回收率。

4. 副产物与纯度评估：

   • 残留巯基检测：使用Ellman试剂（DTNB）对从PAB32M1凝胶回收的DNA溶液进行检测。该试剂与游离巯基反应生成在412 nm有特征吸收的产物。通过比较回收样品与阳性对照（完全还原的PAB1M0凝胶溶液）的紫外-可见吸收光谱，评估回收产物中是否含有因交联剂断裂而产生的巯基副产物污染。

四、 主要研究结果 1. 凝胶的氧化还原响应性与理化性质： * 流变学测试表明，随着凝胶中BISS比例的增加，其初始储能模量（G’）逐渐降低，即凝胶变得更软。更重要的是，经TCEP处理后，含BISS的凝胶G’显著下降，下降幅度与BISS含量成正比。例如，PAB32M1的G’在处理后下降了76.5%，而传统PAGE几乎不变。这证实了二硫键的成功引入和还原触发断裂。 * 拉伸测试显示，PAB32M1凝胶的断裂伸长率约为传统PAGE的8倍，表明其柔韧性和可操作性更佳。 * 溶胀实验表明，PAB32M1凝胶在去离子水中溶胀至原重的113%，而在1 M TCEP中可溶胀至144%，传统PAGE溶胀不明显。视觉观察进一步证实，TCEP处理使PAB32M1凝胶显著软化、膨胀，而PAB1M0则完全溶解。这证明了通过部分替代交联剂，可以实现可控的溶胀而非完全解体。

1. 分子扩散与释放增强：

   • 染料释放实验直观显示，TCEP处理后，PAB32M1凝胶中的染料快速均匀扩散至周围溶液，而传统PAGE凝胶中的染料大部分仍被禁锢在凝胶核心。
   • 扩散系数测定显示，溴酚蓝在PAB32M1凝胶中的扩散系数（6.45 × 10⁻¹⁰ m²/s）显著高于传统PAGE（1.71 × 10⁻¹⁰ m²/s）和BISS比例较低的PAB3M1（2.22 × 10⁻¹⁰ m²/s）。
   • DNA释放动力学曲线表明，在TCEP存在下，PAB32M1凝胶在60分钟内释放了85.1%的包埋DNA，远高于传统PAGE的58.2%。这些结果共同证实，还原剂触发的二硫键断裂使凝胶网络松弛、溶胀，从而极大地促进了生物大分子的扩散和释放。

2. DNA与RNA的分离与高效回收：

   • 电泳图像显示，无论是变性还是非变性条件，PAB32M1凝胶对单链/双链DNA以及单链RNA的分离分辨率均与传统PAGE相当，条带清晰、锐利，表明引入BISS并未损害其核心分离功能。
   • 回收效率是本研究最关键的量化成果：对于15-40个核苷酸长度的DNA，从PAB32M1凝胶中的回收率普遍超过50%，最高可达约63%。相比之下，传统PAGE的回收率仅为25%-30%。这意味着回收效率提高了超过2倍。对于RNA，PAB32M1凝胶也表现出优势，对21-45个核苷酸的RNA回收率在36.2%-37.8%之间，高于传统PAGE的18.5%-24.6%。RNA回收率低于DNA，作者归因于RNA本身更易被RNase降解的特性。

3. 蛋白质应用的初步展示：

   • PAB32M1凝胶能够成功地对GFP进行变性和非变性电泳分离，条带位置正确，在非变性条件下能保持GFP的荧光活性。
   • 荧光观察证实，经TCEP处理后，GFP可以从PAB32M1凝胶中释放到周围溶液中。定量测定显示GFP的回收率约为34%。作者指出，由于GFP不含二硫键，因此能在还原条件下保持结构。但对于含二硫键的蛋白质，此还原条件可能破坏其天然结构，这是该技术应用于蛋白质回收时需要注意的潜在限制，未来或可通过预先保护半胱氨酸残基等策略来拓展应用范围。

4. 产物纯度评估：

   • Ellman试剂检测表明，从PAB32M1凝胶回收的DNA溶液在412 nm处未出现特征吸收峰，与去离子水背景无异，而从完全由BISS交联的PAB1M0凝胶（阳性对照）获得的溶液则有强吸收峰。这证明PAB32M1凝胶在部分交联剂被还原断裂后，产生的可溶性聚合物碎片及游离巯基副产物极少，回收的核酸产物纯度较高，满足下游应用要求。

五、 研究结论与价值 本研究成功开发了一种基于氧化还原响应性聚丙烯酰胺凝胶的电泳纯化新平台。通过用含有二硫键的交联剂BISS部分替代传统的MBA，所制备的PABxMy双交联水凝胶在保持与传统PAGE相当的高分离分辨率的同时，具备了还原剂触发溶胀的特性。这种可控的溶胀行为显著增强了被分离生物大分子（尤其是核酸）从凝胶基质中的扩散与释放，从而将DNA的回收效率提升至最高约63%，是传统方法的2倍以上，且回收产物中聚合物残留污染极低。该平台同样适用于RNA的回收，并对不含二硫键的蛋白质（如GFP）的分离与释放展示了潜力。

本研究的科学价值在于提出并验证了一种“性能保留-功能增强”的智能材料设计策略，即通过引入可断裂的动态共价键（二硫键）来微调传统生物材料（PAGE凝胶）的物理化学性质，赋予其新的、可按需激活的功能（高效释放），而不牺牲其原有的核心功能（高分辨率分离）。这为设计用于生物技术的新型功能化分离介质提供了新思路。

其应用价值十分明确：为需要从凝胶中高效回收纯净核酸样品的研究领域（如分子克隆、测序文库制备、核酸适配体筛选、RNA研究等）提供了一种强有力的互补工具。它可以直接替代或与传统PAGE流程结合使用，在几乎不增加操作复杂度的情况下，大幅提高目标产物的得率。

六、 研究亮点 1. 创新性的材料设计：并非完全替换传统交联剂，而是采用BISS与MBA共存的“双交联”策略。这一巧妙的折中方案既引入了氧化还原响应性，实现了高效释放，又通过永久性MBA交联网络维持了凝胶的基本结构完整性，避免了完全溶解导致的聚合物污染问题，并保证了足够的机械强度以进行常规电泳操作。 2. 显著的性能提升：在基本不改变标准PAGE操作流程的前提下，将DNA回收效率系统性、可重复地提升至传统方法的2倍以上（~63% vs. ~30%），这是该技术最直接、最突出的优势。 3. 广泛的应用兼容性：研究不仅证明了该凝胶对DNA的高效回收，还将其成功应用于RNA，并初步探索了对蛋白质的适用性，展示了其作为通用型生物大分子回收平台的潜力。 4. 深入的机理验证与表征：研究不仅展示了最终的应用效果，还通过系统的流变学、溶胀实验、分子扩散系数测定、释放动力学等一系列物理化学表征，深入阐明了“二硫键断裂→网络溶胀→扩散加速→释放增强”这一核心工作机制，使整个研究逻辑严密，结论可靠。 5. 对产物纯度的关注与验证：通过Ellman实验积极评估了可能由交联剂断裂带来的副产物污染问题，并证明了PAB32M1配方下污染可忽略不计，增强了该技术的实用性和可信度。

七、 其他有价值的要点 作者在讨论中指出了该技术的当前局限性和未来展望：对于含有二硫键的蛋白质，所使用的还原条件（TCEP）可能会破坏其天然结构和功能。这提示该技术更适用于不含二硫键的蛋白质或经过适当修饰（如烷基化保护巯基）的蛋白质。这一坦诚的讨论为后续研究指明了方向，例如探索其他类型的可断裂键（如对特定酶敏感或光敏感的键）以拓展应用范围。此外，研究中的所有实验均提供了详细的配方、条件和重复次数（n=3），数据以均值±标准差形式呈现，符合严谨的科学研究规范。支持信息中包含了详细的合成方法、水凝胶照片、流变学图谱、溶胀曲线、紫外光谱等补充数据，进一步支撑了正文中的结论。