本文献《Nanobodies: natural single-domain antibodies》是一篇发表于Annual Review of Biochemistry（年度生物化学评论）2013年3月刊的综述文章。作者是来自Vrije Universiteit Brussel（布鲁塞尔自由大学）细胞与分子免疫学研究组及VIB（佛兰德生物技术研究所）结构生物学系的Serge Muyldermans。这篇综述全面总结了骆驼科动物（如骆驼、羊驼）体内天然存在的重链抗体（Heavy-chain antibodies， HcAbs）及其衍生出的纳米抗体（Nanobodies， Nbs 或单域抗体， sdAbs）的研究进展。文章系统性地阐述了其结构特征、遗传学基础、生化特性，并详细介绍了纳米抗体在科研、诊断及治疗等领域的广泛应用前景。
一、 重链抗体与纳米抗体的结构特征
骆驼科动物血清中同时存在常规的四聚体抗体和独特的同源二聚体重链抗体（HcAbs）。重链抗体完全缺乏轻链（Light chain， L chain），并且其重链缺失了第一个恒定区（CH1）。这使得最小的功能性抗原结合片段仅由一个单一的抗原结合域——即可变重链区（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibodies， VHH）构成。这种单域抗体因其尺寸在纳米级而被称为“纳米抗体”。
VHH与常规抗体的VH结构域在结构上相似，但存在关键差异。首先，在框架区2（FR2），VHH中原本用于与VL结合的疏水性氨基酸（如Val47， Gly49， Leu50， Trp52）被替换为更小、更具亲水性的氨基酸（如Phe42， Glu49， Arg50， Gly52）。这种重塑消除了VHH与轻链结合的倾向，使其能够独立、稳定地作为单域存在。其次，由于缺少了VL的贡献，VHH的互补决定区（Complementarity-determining regions， CDRs），尤其是CDR3，通常更长，以提供足够大的抗原结合表面积（约600-800 Ų）。为了补偿长环带来的构象柔性，许多骆驼来源的VHH在其CDR1和CDR3之间形成了额外的链内二硫键，这限制了环的灵活性，增强了稳定性。在羊驼VHH中，这种二硫键的出现频率较低，且其CDR3通常也较短。VHH的结构形成了一个凸出的抗原结合表面，使其特别擅长结合抗原表面的凹槽或空腔，例如酶的活性位点，这使得许多纳米抗体成为有效的酶抑制剂或功能调节剂。有趣的是，鲨鱼中存在的IgNAR抗体也是缺乏轻链的同源二聚体，其可变区（V-NAR）与VHH在结构和功能上表现出惊人的趋同进化，尽管它们的序列差异很大。
二、 重链抗体的基因基础与发育起源
骆驼科动物的重链抗体和常规抗体由基因组中同一免疫球蛋白重链基因座（H locus）编码。该基因座包含多种V基因（包括用于常规抗体的IGHV基因和用于重链抗体的专属IGHVH基因）、D基因、J基因以及下游的恒定区基因（IGHM， IGHD， IGHG， IGHE， IGHA）。用于产生重链抗体的专属IGHG基因在CH1外显子的5‘剪接受体位点存在一个点突变（G→A），破坏了标准的GT剪接信号，导致在mRNA加工过程中CH1区域被整体切除，从而产生缺少CH1的重链。
VHH结构域由专属的IGHVH基因通过V-D-J重排形成。与常规IGHV基因相比，IGHVH基因在CDR1或FR2区域通常编码一个额外的半胱氨酸密码子，而CDR3中的第二个半胱氨酸则是在V-D-J重排过程中或之后通过体细胞超突变引入的，两者共同形成稳定CDR环的二硫键。此外，IGHVH基因的CDR1编码区含有更容易发生体细胞超突变的“热点”（如酪氨酸密码子），这促进了抗原结合多样性的快速产生。值得注意的是，研究发现某些原本用于常规抗体的V基因（如IGHV4家族）在骆驼科动物中具有“混杂性”，既能产生与轻链配对的VH，也能产生独立发挥功能的类VHH单域，这进一步丰富了单域抗体的库容。
关于重链抗体在B细胞中的个体发育（Ontogeny）仍是一个有待深入研究的领域。当前的工作假设是：当B细胞前体发生涉及IGHVH基因（或产生Trp118突变的IGHV基因）的V-D-J重排后，所表达的VHH结构域可能无法与替代轻链（Surrogate light chain）有效结合，从而无法在细胞表面形成完整的前B细胞受体（pre-BCR）并传递生存信号。在骆驼科动物中，这类B细胞可能通过立即发生从IGHM到专属的IGHG2/IGHG3的类别转换（Class switch）而得以“获救”，并最终发育成分泌功能性重链抗体的浆细胞。
三、 纳米抗体的生化特性与优势
纳米抗体拥有一系列卓越的生化特性，使其成为极具吸引力的生物技术工具。首先，易于获取与筛选：通过免疫骆驼科动物，从外周血淋巴细胞中克隆VHH基因库，并利用噬菌体展示（Phage display）等技术进行筛选，可以在短时间内获得高亲和力、高特异性的纳米抗体。由于VHH由一个约360 bp的单一外显子编码，文库构建简单高效，小至10^6容量的文库即具有代表性。其次，高亲和力与可成熟性：从免疫文库中直接克隆出的纳米抗体通常是体内亲和力成熟的产物，其平衡解离常数（Kd）可达纳摩尔甚至皮摩尔水平。此外，还可以通过体外进化技术（如误差倾向PCR、核糖体展示等）进一步优化其亲和力或稳定性。
第三，出色的表达与稳定性：纳米抗体可以在多种系统中高效表达，包括细菌（如大肠杆菌周质腔）、酵母、哺乳动物细胞和植物。其产量高，纯化简便（常使用His标签）。纳米抗体具有非凡的稳定性，可耐受高温（许多在60-80°C仍保持活性，部分可耐受90°C以上）、化学变性剂（如盐酸胍）以及极端pH值。通过引入额外的二硫键（如在Cys54和Cys78之间）或进行定向进化，可以获得抗蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）降解的变体，这为口服给药提供了可能。第四，低免疫原性：纳米抗体序列与人类VH家族3同源性高，且其小尺寸和快速血液清除特性进一步降低了在人体内引发免疫反应的风险。通过“人源化”改造（替换VHH中与人类VH不同的少数关键氨基酸），可以进一步最小化其免疫原性。
第五，独特的抗原识别模式与多功能构建能力：纳米抗体倾向于结合抗原的隐蔽表位或功能位点（如酶活性中心），因此常具有中和活性或调节功能（作为抑制剂、激动剂或拮抗剂）。其严格的单体行为和模块化特性，使其成为构建多价、多特异性分子的理想“积木”。可以方便地构建双价（增强亲合力）、双表位（针对同一抗原的不同表位，增强中和能力）或双特异性（同时靶向两个不同抗原）的融合蛋白。此外，纳米抗体还可以与Fc片段、白蛋白、或其他效应分子融合，以延长其半衰期或赋予新的功能。
四、 纳米抗体的应用前景
基于上述优异特性，纳米抗体在多个领域展现出广阔的应用前景。在基础研究工具方面：1) 细胞内工具（Chromobodies/Fluobodies）：将纳米抗体与荧光蛋白融合并在细胞内表达，可用于实时、特异性地标记和追踪内源蛋白的动态、定位及构象变化。2) 功能干扰：细胞内表达靶向特定蛋白的纳米抗体，可以阻断蛋白质-蛋白质相互作用，实现“细胞内免疫”，用于靶点验证和功能研究。3) 蛋白降解：将纳米抗体与E3泛素连接酶组分（如F-box结构域）融合，可引导靶蛋白发生泛素化并被蛋白酶体降解，这是一种新型的靶向蛋白降解策略。4) 结晶伴侣：纳米抗体能够稳定高度动态、易聚集的蛋白质（尤其是膜蛋白）的特定构象，协助其结晶，从而解决结构生物学中的难题，已成功用于解析多个“难结晶”蛋白的结构。
在诊断应用方面：1) 体外检测：纳米抗体可用于开发高灵敏度、高特异性的免疫检测试剂（如ELISA、生物传感器）。其小尺寸允许进行定向固定化，最大化抗原捕获能力。2) 亲和纯化：固定化的纳米抗体可作为高效的亲和层析介质，用于特异性地富集和纯化目标蛋白，商业化产品（如抗GFP、抗各种免疫球蛋白同种型的纳米抗体）已广泛应用。3) 体内成像：纳米抗体的小尺寸使其能快速渗透组织并迅速从血液中清除（经肾脏滤过），非常适合与短半衰期放射性核素（如68Ga， 18F）偶联，用于正电子发射断层扫描（PET）等分子影像学检查，实现肿瘤、炎症病灶等高对比度、低背景的早期诊断。
在治疗应用方面：1) 中和毒素与病原体：针对蛇毒、蝎毒、细菌毒素或病毒表面蛋白的高中和活性纳米抗体，可用于急性中毒或感染的急救治疗。其小尺寸可能有助于接触到常规抗体无法触及的隐藏表位。2) 靶向治疗：多个纳米抗体药物已进入临床研发阶段，靶点包括炎症因子（如IL-6R， TNF-α）、凝血相关蛋白（如vWF）、骨代谢靶点（如RANKL）等，用于治疗自身免疫性疾病、血栓性疾病和骨质疏松等。3) 药物递送：纳米抗体可作为“导航头”，将药物、毒素或放射性同位素特异性地递送至病变组织（如肿瘤）。更有价值的是，正在开发能够穿越血脑屏障或促进上皮细胞跨细胞转运的纳米抗体，为中枢神经系统疾病治疗和口服生物制剂的开发开辟新途径。
五、 总结与未来展望
这篇综述系统性地总结了截至2013年关于天然单域抗体——纳米抗体的知识体系。其核心亮点在于：揭示了骆驼科动物重链抗体这一独特的自然现象；阐明了VHH结构域通过关键氨基酸替换和独特环结构获得自主功能的分子机制；概述了其从基因到功能抗体的发育假说；并全面展示了纳米抗体因其小尺寸、高稳定性、强穿透性、易于工程化改造和多功能构建等综合优势，正在成为超越传统抗体的新一代强大工具。
文章最后指出了未来的研究方向：1) 更深入了解骆驼科动物的免疫系统，特别是不同HcAb亚型的精确功能和重链抗体的完整个体发育过程；2) 继续扩展纳米抗体的工具箱，开发用于染色质免疫共沉淀、超分辨率成像、表型筛选等新应用的试剂；3) 优化纳米抗体药物的药代动力学性质（如延长半衰期），并开发创新的递送方式（如穿越生物屏障、病毒载体递送）；4) 推动更多纳米抗体疗法完成临床开发并实现商业化。
Serge Muyldermans的这篇综述不仅是该领域的权威总结，也清晰地描绘了纳米抗体从基础生物学奇观转化为革命性生物技术平台的路线图，对其在生命科学和医学领域的持续发展产生了深远影响。