研究报告

主要作者及发表信息

本研究由Bin Li、Baoqing Ren（共同第一作者）、Jingyu Deng（通讯作者）等学者合作完成。研究团队主要来自天津医科大学肿瘤医院胃外科，部分作者来自山西省人民医院胃肠胰外科。该论文于2023年发表在学术期刊《Clinical Epigenetics》上。

研究背景与目的

胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。尽管晚期胃癌的诊疗策略有所进步，但其治疗仍不理想，预后较差。因此，阐明胃癌发病的分子机制，探索新的临床治疗靶点，具有重要的科学和临床意义。锌指转录因子（zinc finger transcription factors）超家族是最大的转录因子家族，其成员在细胞进程的各方面发挥关键作用。锌指SCAN结构域包含蛋白18（zinc finger and scan domain containing 18, ZSCAN18）是该家族的一员，也被称为ZNF447。已有研究发现，ZSCAN18启动子区域的高甲基化（hypermethylation）在食管癌、肾细胞癌、胆管癌、结直肠癌及胃癌等多种癌症中均有发现，且在胃肠道癌症中其蛋白表达水平较低，这强烈提示ZSCAN18可能具有抑癌功能。然而，ZSCAN18在胃癌中因高甲基化而沉默的具体机制和功能尚不明确。因此，本研究旨在深入探究ZSCAN18在胃癌中的表观遗传调控、生物学功能及其下游分子机制，以期为其作为胃癌诊断和治疗靶点提供理论依据。

研究流程与方法

本研究采用了多步骤的实验流程，从临床样本分析到体内外功能实验，系统性地揭示了ZSCAN18在胃癌中的作用。

第一步：ZSCAN18在胃癌组织中的表达与临床意义分析。研究团队首先通过生物信息学分析，利用TCGA公共数据库及GEO数据集（登录号GSE33335），发现ZSCAN18在包括胃癌在内的多种肿瘤组织中表达下调。随后，他们收集了30对胃癌及癌旁非肿瘤组织，使用定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测ZSCAN18的mRNA表达水平，证实了其在癌组织中的下调。为了评估蛋白水平的表达，研究人员对83对胃癌及癌旁组织进行了组织芯片免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色，通过半定量评分系统评估ZSCAN18蛋白的表达强度与定位。同时，结合患者的临床病理资料和随访信息，采用Kaplan-Meier法和Cox回归模型进行生存分析，以评估ZSCAN18表达与胃癌患者预后的相关性。

第二步：ZSCAN18在胃癌中高甲基化状态与预后关系的研究。为探究ZSCAN18下调的原因，研究者聚焦于表观遗传学改变，特别是DNA启动子甲基化。他们通过分析公共数据集（GSE30601）初步确认了ZSCAN18在胃癌中的高甲基化水平。接着，利用MassARRAY技术，对97例胃癌组织和6例癌旁组织的ZSCAN18启动子区域（从-209到+280 bp，包含50个CpG岛）进行了定量甲基化分析，以明确甲基化的具体位点和水平。同样地，他们将甲基化数据与患者生存信息关联，分析了特定CpG位点（如CpG45.46）高甲基化对预后的独立预测价值。

第三步：胃癌细胞系中ZSCAN18因启动子高甲基化而沉默的确认。研究者在8种胃癌细胞系（MKN45, NCI-N87等）和一种正常胃上皮细胞系（GES-1）中，通过qRT-PCR检测ZSCAN18的mRNA表达，并通过MassARRAY分析其启动子甲基化水平，并计算了两者之间的相关性。为验证甲基化是导致基因沉默的直接原因，研究者选取了高甲基化且低表达ZSCAN18的AGS和NCI-N87细胞系，用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（5-aza-2′-deoxycytidine, DAC）进行处理，随后检测ZSCAN18的mRNA表达和启动子甲基化水平的变化。

第四步：ZSCAN18恢复表达后对胃癌细胞功能的体外和体内研究。为了明确ZSCAN18的生物学功能，研究者在AGS和NCI-N87细胞中通过质粒（plvx-ires-puro-zscan18）转染过表达ZSCAN18。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit 8, CCK-8）实验和集落形成实验（colony formation assay）评估过表达后细胞增殖能力的改变。在体内实验方面，建立了裸鼠皮下异种移植瘤模型，将过表达ZSCAN18的NCI-N87细胞和对照组细胞分别接种于裸鼠皮下，定期测量肿瘤体积，以评估ZSCAN18对体内肿瘤生长的影响。

第五步：ZSCAN18下游分子机制的探索。为阐明ZSCAN18抑癌的分子机制，研究者对过表达ZSCAN18和空载体对照的NCI-N87细胞进行了RNA下一代测序（RNA next-generation sequencing, RNA-seq），筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，锁定了自噬（autophagy）通路。随后，通过蛋白质印迹法（western blot）检测自噬相关蛋白LC3-II/I和p62/SQSTM1的表达变化，并利用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染结合荧光显微镜观察自噬流（autophagic flux）。作为功能验证，研究者使用了自噬抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）和自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin, RAP）处理细胞，通过检测细胞活力（使用ATP法）和自噬蛋白变化，确认ZSCAN18对增殖的抑制效应是否通过自噬介导。

第六步：ZSCAN18靶基因TP53INP2的鉴定与调控机制研究。根据RNA-seq结果，研究者关注到与自噬相关的基因——肿瘤蛋白53诱导的核蛋白2（tumor protein 53-induced nuclear protein 2, TP53INP2）。通过生物信息学分析，发现ZSCAN18与TP53INP2在胃癌组织中表达正相关。在AGS和NCI-N87细胞中过表达ZSCAN18后，用qRT-PCR和western blot检测TP53INP2的表达变化。鉴于ZSCAN18是转录因子且定位于细胞核，研究者利用Cistrome数据库的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）信息进行生物信息学分析，寻找ZSCAN18在TP53INP2启动子区域的富集峰。最后，通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验，在AGS和NCI-N87细胞中验证ZSCAN18蛋白能否与TP53INP2启动子区域特异性结合。

第七步：TP53INP2的功能研究及回补实验。研究者首先通过TCGA数据库分析和IHC染色，验证TP53INP2在胃癌组织中的低表达。接着，在AGS和NCI-N87细胞中过表达TP53INP2，评估其对细胞增殖（CCK-8和集落形成实验）和自噬（western blot和荧光显微镜）的影响。最后，为了证明ZSCAN18的抑癌功能是依赖于TP53INP2的，研究者设计了功能回复实验。他们在AGS和NCI-N87细胞中设立了三个处理组：ZSCAN18过表达联合TP53INP2敲低组、ZSCAN18过表达联合空载体对照组、以及空载体联合空载体对照组。通过比较各组在体外增殖、体内肿瘤生长以及自噬水平上的差异，来明确ZSCAN18-TP53INP2通路的完整性对ZSCAN18抑癌功能的必要性。

研究结果与结论

研究首先揭示了ZSCAN18在胃癌组织及多种细胞系中显著低表达，且这种低表达与患者预后不良独立相关。同时，与癌旁正常组织相比，胃癌组织中ZSCAN18启动子呈现高频高甲基化，其中CpG45.46位点的高甲基化是胃癌患者生存期缩短的独立预后因素。细胞实验证实，胃癌细胞系中ZSCAN18的表达与其启动子甲基化水平呈显著负相关，而DAC去甲基化处理能够恢复其表达，明确了启动子高甲基化是导致ZSCAN18转录沉默的关键机制。

功能实验结果表明，恢复ZSCAN18的表达能够显著抑制胃癌细胞的增殖和集落形成能力，并在裸鼠体内抑制异种移植瘤的生长，确立了ZSCAN18在胃癌中的抑癌基因角色。机制研究发现，ZSCAN18过表达能够激活自噬通路，表现为LC3-II/I比例升高和p62蛋白减少及自噬体数量增加。使用自噬抑制剂CQ能部分逆转ZSCAN18对细胞增殖的抑制，而自噬激活剂RAP则增强此效应，证明ZSCAN18通过诱导自噬来抑制胃癌细胞增殖。进一步，研究通过RNA-seq和ChIP实验发现并证实，ZSCAN18作为一个转录因子，能够直接结合到TP53INP2基因的启动子区域，转录激活其表达。TP53INP2本身在胃癌中低表达，过表达TP53INP2同样能抑制增殖并诱导线粒体自噬。至关重要地，功能回复实验显示，当在过表达ZSCAN18的同时敲低TP53INP2，ZSCAN18对胃癌细胞增殖的抑制和自噬的激活作用均被显著削弱。

本研究首次阐明，在胃癌中ZSCAN18因启动子高甲基化而表达沉默，ZSCAN18作为一种转录因子，通过转录激活下游靶基因TP53INP2的表达，进而增强细胞自噬，最终抑制胃癌细胞的增殖。这一发现揭示了ZSCAN18启动子高甲基化作为预后标志物的潜力，并为胃癌治疗提供了一个新的潜在靶点。

研究亮点

本研究的主要亮点在于系统性阐述了一个完整的分子调控轴“ZSCAN18-TP53INP2-自噬”在抑制胃癌进展中的作用。首先，研究不仅证实了ZSCAN18的表观遗传学失活机制，还首次将其特定的CpG位点（CpG45.46）高甲基化确立为一个独立的胃癌预后生物标志物，这具有潜在的临床转化价值。其次，创新性地揭示了ZSCAN18作为转录因子直接结合并调控TP53INP2基因表达的新机制，连接了转录调控与自噬这两个关键生命活动。最后，通过系列严谨的体内外功能恢复实验，确凿地证明了TP53INP2是ZSCAN18发挥抑癌功能的必要下游效应分子，结构完整，逻辑严密。该研究为理解胃癌发病的表观遗传学与转录调控机制提供了新的见解，并为开发基于恢复ZSCAN18表达或靶向其下游通路的新型治疗策略奠定了坚实的理论和实验基础。