本研究由Junlong Wu、Yuda Lin、Kaiwei Yang等作为共同第一作者，来自复旦大学上海癌症中心、天津医科大学第二医院、北京大学第一医院以及Acornmed Biotechnology Co., Ltd.的研究团队联合完成，通讯作者包括Feng Lou、Shanbo Cao、Wei Yu、Hailong Hu和Dingwei Ye。论文发表于*Molecular Cancer*期刊，2024年第23卷，文章编号57，DOI为10.1186/s12943-024-01974-4。该研究开发并验证了一种名为“mt-utDNA”（multitarget urine tumor DNA）的多靶点尿液肿瘤DNA检测方法，用于尿路上皮癌（urothelial carcinoma，UC）的非侵入性诊断。
尿路上皮癌是全球最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，主要包括膀胱癌（bladder cancer，BCA）和上尿路尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）。早期发现UC与良好预后密切相关，局限性肿瘤患者的5年生存率超过90%。UC最常见的症状是血尿，但仅有不到20%的血尿患者最终被诊断为恶性肿瘤。目前诊断的金标准是膀胱镜检查联合活检，但该方法费用高、具有侵入性且患者依从性低。尿液细胞学作为膀胱镜的辅助手段，对低级别肿瘤和UTUC的敏感性不理想。其他已获批的尿液检测如NMP22和UroVysion FISH在常规实践中的应用也因准确性欠佳而受到限制。因此，临床迫切需要一种非侵入性、便捷且更有效的UC检测工具。
该研究分为两个阶段：算法开发阶段和临床验证阶段。算法开发使用了一个回顾性病例对照队列（n=382），临床验证则在一项双盲、多中心、前瞻性试验（n=947；注册号ChiCTR2300076543）中进行。据作者所知，这是目前覆盖BCA和UTUC的最大规模UC诊断研究。
在算法开发阶段，研究团队首先确定了参考基因和单个靶点的截断值。随后，为提高临床应用的准确性和便利性，构建了一个整合预测模型，以UC-score作为输出。模型在训练集（n=252）上进行训练，并确定截断值（UC-score≥0视为阳性），以平衡敏感性和假阳性率。之后在测试集（n=130）中验证了已建立的截断值。UC-score在测试集中的曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）为0.9342，敏感性为89.23%，特异性为92.31%。该模型整合了FGFR3和TERT基因突变的检测以及ONECUT2和VIM基因异常甲基化的检测，利用多靶点协同效应提高对早期肿瘤的检出能力。
在前瞻性临床验证阶段，最终纳入了947名参与者，其中417名为病理确诊的UC患者，391名为良性泌尿系统疾病患者，139名为非UC癌症患者。UC患者的UC-score显著高于良性疾病或非UC癌症患者（p<0.001）。UC-score随肿瘤分级和分期的增加而升高，但在位于膀胱、输尿管或肾盂的肿瘤之间差异不大。该检测的AUC为0.9583，对UC患者的敏感性为91.37%（381/417），总体特异性为95.09%（504/530），对良性泌尿系统疾病的特异性为94.88%（371/391）。检测结果与病理诊断之间具有高度一致性（κ=0.8668）。此外，三个独立中心之间表现稳定，证明了该检测的稳健性。
在不同分期和分级的UC患者中，检出率随肿瘤分期和分级的升高而增加（p<0.001），对Ta期、T1期和T2及以上肿瘤的敏感性分别为78.22%、94.47%和100%。值得注意的是，在Ta期肿瘤中，低级别肿瘤的检出率为75.81%，高级别肿瘤的检出率为93.94%，表明该检测优于Oh和Deng等研究中报道的单标志物检测。该检测还同时实现了对BCA和UTUC的检测，两者敏感性均超过90%。对泌尿系统良性病变和非UC癌症的敏感性普遍较低，表明该检测对常见混杂因素具有较强的抗干扰能力。
在与其他尿液检测方法进行的头对头比较中，mt-utDNA检测的敏感性显著优于尿液细胞学（p<0.001）、NMP22检测（p<0.001）和UroVysion FISH（p=0.039），而特异性相当。与细胞学相比，mt-utDNA检测在Ta期（p=0.012）和低级别肿瘤（p=0.011）中的敏感性提高了约2倍。该优势在分期、分级和位置各亚组中普遍存在。特异性比较呈相似趋势，但由于配对结果不足未观察到统计学显著性。
在单项靶点准确性验证中，Sanger测序确认单靶点准确性与测序结果的一致性为98.45%至100%。在术后研究中，随机选择的UC患者中97.7%（43/44）的UC-score下降（p<0.001），82.1%（32/39）在切除后发生阳性转阴，强烈提示阳性结果确实由切除肿瘤释放的信号所致。这些结果表明UC-score可能与肿瘤负荷相关，或可提示UC的存在或残留，但尚需长期随访研究加以证实。
研究结论认为，该新开发的mt-utDNA检测在迄今为止最大规模的多中心前瞻性临床试验中展现了有效性。其突出表现，尤其是对早期和低级别肿瘤的高敏感性，突显了其作为UC筛查和诊断辅助工具的潜力。该检测的阳性预测值为93.61%，阴性预测值为93.33%。根据血尿人群UC发病率（显微血尿为3.3%，肉眼血尿为17%）估算，阴性预测值分别可达99.69%和98.17%。结合美国泌尿外科学会血尿风险分层，该检测有望提供更准确的风险分层，促进临床决策并加快疑似UC患者的转诊。
本研究的亮点在于：第一，这是覆盖BCA和UTUC的最大规模前瞻性多中心UC诊断临床试验；第二，mt-utDNA检测整合了基因突变和DNA甲基化多靶点，其对早期低级别肿瘤的敏感性显著优于现有方法；第三，该检测在保持高特异性的同时，对UC的总体敏感性超过91%；第四，术后UC-score显著下降及阳性转阴现象提示其可能反映肿瘤负荷和残留状态，具有潜在的疗效监测和复发监测价值。
研究也存在一些局限性：方法学比较中纳入的患者数量有限，缺乏在代表性人群中充分评估的效能；入组基于有症状人群，无症状人群筛查的可行性仍需大规模前瞻性研究评估；mt-utDNA检测与年龄、性别、血尿等风险因素联合的临床有效性尚待验证；缺乏长期随访数据；随机排尿对检测的潜在影响有待进一步研究；该研究在中国进行，其他人群的普适性尚需评估。