本研究由Büşra Merve Sarıtaş、Aybek Yiğit、Ayşe Karacalı Tunç和Fetiye Kolaylı共同完成，通讯作者为Büşra Merve Sarıtaş。研究团队分别来自Kocaeli大学医学微生物学系、Iğdır大学研究实验室应用与研究中心以及Iğdır大学牙科学院。该研究于2024年4月16日发表在Cureus期刊（Cureus 16(4): e58368），论文DOI为10.7759/cureus.58368，文章类型为原创研究论文。
龋齿是全球范围内影响最为广泛的口腔疾病之一。根据世界卫生组织2022年发布的全球口腔健康状况报告，口腔疾病影响全球约35亿人口，其中约75%的患者生活在中收入国家。变形链球菌（Streptococcus mutans, S. mutans）已被确认为龋齿的主要致病菌，其最显著的特征之一是能够形成生物膜。生物膜是由微生物嵌入自身产生的胞外基质中形成的复杂群落，能够牢固黏附于天然牙齿和牙科修复体表面。这种由多糖、蛋白质和胞外DNA组成的生物膜基质不仅能为细菌抵御pH波动和营养缺乏等环境挑战提供保护屏障，还能增强细菌的黏附能力，使变形链球菌在牙面牢固定植，进一步促进生物膜内部产酸和耐酸环境的形成。
传统的龋齿防治手段，如抗生素的使用，存在细菌耐药性发展的风险。因此，寻找不促进细菌耐药性且具有强杀菌性能的新型物质成为迫切需求。纳米颗粒（nanoparticles, NPs）因其独特的理化性质而成为极具潜力的候选物质。利用绿色化学方法合成纳米颗粒能够减少有害化学品的使用，更加环境友好。火龙果（pitaya, Hylocereus spp.）植物提取物富含多种生物活性成分，可作为纳米颗粒合成的还原剂和稳定剂。
本研究旨在评估以火龙果植物提取物通过绿色合成方法制备的银铜双金属纳米颗粒（Ag-Cu NPs）对变形链球菌的抑制效果，包括其最低抑菌浓度和抗生物膜活性，以探索其在龋齿预防中的潜在应用价值。据研究者所知，关于Ag-Cu NPs对变形链球菌的杀菌活性和抗生物膜活性的研究尚不多见。
本研究包含五个主要实验环节：植物提取物的制备、Ag-Cu NPs的绿色合成、纳米颗粒的表征、抗菌活性测定以及抗生物膜效应评估。
研究团队采集火龙果植物的叶片，将其切碎后用蒸馏水充分清洗，随后在35°C低温烘箱中干燥五天。干燥后的叶片被精细粉碎，置于250毫升锥形瓶中，加入100毫升蒸馏水，在70°C下用磁力搅拌器持续搅拌30分钟，期间用铝箔覆盖瓶口以防止挥发性成分损失。搅拌结束后，使用孔径为0.22毫米的滤纸对植物样品进行过滤。所得滤液在+4°C条件下储存备用。
取10毫升植物滤液，加入90毫升蒸馏水、20毫克硝酸银和20毫克氯化铜（II）。在室温条件下使用磁力搅拌器混合，并用铝箔覆盖避光反应12小时。在加入硝酸银后，氯化铜溶液的颜色由浅蓝色变为深蓝色，加入植物提取物后溶液进一步变为深绿色，表明还原反应正在进行。12小时后，样品在4,000转/分钟条件下离心五分钟，重复三次（两次用水、一次用乙醇洗涤）。得到的固体物质在60°C烘箱中干燥，用于后续表征。
研究者采用三种互补技术对合成的Ag-Cu NPs进行全面表征：
扫描电子显微镜（SEM）：使用Carl Zeiss Sigma 300型SEM（德国）配合in-lens探测器，在10 kV加速电压下观察样品的形貌结构。通过SEM-EDX还测定了银和铜的重量百分比。
紫外-可见光谱（UV-Vis）：使用Cary 60 Agilent Technologies型紫外-可见分光光度计（美国），在300至800纳米波长范围内测定Ag-Cu NPs的光学性质和吸收光谱。
傅里叶变换红外光谱（FT-IR）：使用Agilent Cary 630型FT-IR设备（美国）以及PerkinElmer Spectrum Two（KBr）系列设备对样品进行表征，以确定纳米颗粒表面的官能团组成。
采用微量肉汤稀释法在96孔U型底微量板中测定纳米颗粒的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。每孔加入100微升脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth, BHIB），然后加入100微升浓度为1024 μg/ml的Ag-Cu双金属纳米颗粒进行二倍梯度稀释。实验设置阴性对照（不含纳米颗粒）、阳性对照（0.02%氯己定，chlorhexidine, CHX）以及火龙果提取物水溶液作为比较。研究使用变形链球菌HF 676标准菌株，从-80°C冻存中取出后进行两次传代培养。从生长菌落制备0.5麦氏浊度的细菌悬液（以0.9% NaCl溶液配制），并按1:10比例稀释。除最后一个孔外，所有孔中加入5微升稀释后的细菌悬液。微量板在37°C、5% CO₂烛缸中培养24小时。以无可见细菌生长的最低浓度判定为MIC值。
采用结晶紫染色法在96孔平底微量板中评估纳米颗粒对生物膜形成的抑制作用。所有孔中加入180微升含2%蔗糖的BHIB。为测定生物膜形成的抑制效果，将纳米颗粒溶液从256 μg/ml浓度开始进行二倍梯度稀释后加入各孔，接种20微升细菌悬液后培养。培养结束后，去除浮游细菌，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）洗涤三次。微量板干燥后，加入200微升95%甲醇进行固定，随后加入0.1%结晶紫染色15分钟。染色完成后用蒸馏水洗涤三次，加入200微升乙醇溶解结合的染料。使用多孔分光光度计在630纳米波长处测定光密度（optical density, OD）值。生物膜抑制率通过比较处理组与对照组的OD值计算得出。
FT-IR光谱显示，Ag-Cu NPs呈现多个特征吸收峰，分别对应O-H、C-C和C-O官能团的伸缩和弯曲振动。其中3000至4000 cm⁻¹区间的强振动与羟基（OH）基团相关，1500至2000 cm⁻¹区间的强振动与酸基的羰基和酰胺基团相关，约1000 cm⁻¹处的峰归属于Ag-Cu NPs本身。与单纯火龙果提取物和银纳米颗粒相比，Ag-Cu NPs的FT-IR图像呈现出略微更加平坦的特征，表明纳米颗粒表面成功包覆了来自植物提取物的有机功能团。
SEM观察显示，合成的Ag-Cu NPs呈球形结构。SEM-EDX分析进一步确认了银和铜元素的存在，且银的重量百分比高于铜。UV-Vis光谱在文献报道的典型波长范围内获得了Ag-Cu NPs的特征吸收峰，最高峰归属于Ag-Cu纳米颗粒的等离子体共振吸收。
以上三种表征手段的结果相互印证，确认了球形形貌的Ag-Cu双金属纳米颗粒被成功合成，植物提取物中的有机成分有效地包覆在纳米颗粒表面。
实验验证了阳性对照中仅加入细菌即可满足细菌生长条件，无菌对照则确认了培养基无污染。以可见生长消失的第一个孔判定MIC值。结果显示，Ag-Cu双金属纳米颗粒对变形链球菌的MIC为128 μg/ml，表明其具有明确的抗菌活性。火龙果提取物本身未表现出任何抗菌效果，说明抗菌活性来源于纳米颗粒而非植物提取物。阳性对照氯己定的MIC为0.0006%。这一结果证实了双金属纳米颗粒的抗菌活性，同时排除了植物提取物直接抑菌的可能性。
抗生物膜实验结果展示了Ag-Cu NPs对变形链球菌生物膜形成的显著抑制效果。在256 μg/ml浓度下，Ag-Cu双金属纳米颗粒表现出高达94%的生物膜抑制率；即使在较低的32 μg/ml浓度下，仍观察到44%的显著生物膜抑制效果。这一浓度依赖性效应表明，Ag-Cu NPs破坏生物膜形成的能力随浓度升高而增强，为其在口腔护理产品中的剂量设计提供了重要参考。
抗菌活性（MIC为128 μg/ml）的结果为后续抗生物膜实验提供了浓度选择依据——抗生物膜实验中使用的最高浓度为256 μg/ml（即2×MIC），这一浓度在保证有效性的同时，也为评估更高浓度下的生物膜抑制潜力提供了空间。生物膜抑制实验的结果进一步支持了研究结论：Ag-Cu NPs不仅能抑制浮游细菌的生长，更重要的是能够有效阻断变形链球菌生物膜的形成。这一发现具有特殊的临床意义，因为生物膜状态下的细菌比浮游细菌对抗菌剂的耐受性更强，能够从源头阻断生物膜形成是预防龋齿的关键策略。
本研究成功合成了具有抗菌和抗生物膜活性的Ag-Cu双金属纳米颗粒，其对变形链球菌的MIC为128 μg/ml，在256 μg/ml浓度下可抑制94%的生物膜形成。这些发现表明Ag-Cu NPs有望作为新型防龋材料应用于漱口水、牙膏和牙科充填材料中。通过绿色化学方法合成纳米颗粒代表了更加环境友好的技术路线，而预防生物膜形成的策略则为应对抗菌素耐药性和生物膜清除难题提供了有前景的方向。
然而，研究者也明确指出，更高浓度下纳米颗粒的潜在细胞毒性及其对口腔微生物群落的长期影响尚未完全阐明，必须通过全面的毒性研究来确保Ag-Cu NPs的口腔使用安全性。此外，体外研究虽有价值，但要转化为临床应用，还需通过体内模型和后续临床试验进行严格验证。
本研究的突出亮点包括：第一，采用火龙果植物提取物作为还原剂和稳定剂进行Ag-Cu双金属纳米颗粒的绿色合成，方法环保且新颖；第二，针对口腔重要致龋菌变形链球菌，系统评估了Ag-Cu NPs的抗菌和抗生物膜双重活性，且抗生物膜抑制率高达94%，效果显著；第三，关于Ag-Cu双金属纳米颗粒（而非单一金属纳米颗粒）对变形链球菌的研究尚属少见，填补了该领域的知识空白；第四，将纳米技术的绿色合成与口腔微生物防治相结合，为龋齿预防提供了跨学科的新思路。未来研究可进一步探索这些纳米颗粒作为候选药物在细胞毒性评估和实验动物模型中的表现。