本研究由Fengen Wang、Min Ding、Ruiju Li、Kun Wang、Xiuxin Zhao、Xia Li、Zengmei Li、Shiming Guo、Ligang Deng*和Jianbin Li*合作完成，研究团队主要来自山东省农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所、动物科学与兽医学研究所以及太原动物园等机构。研究成果于2025年发表在*Journal of Dairy Science*（第108卷第5期），标题为《Determination of A1 and A2 β-Casein in Cow Milk by High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry》。
学术背景
β-酪蛋白（β-CN）是乳制品中最主要的蛋白质，占牛奶蛋白质含量的约80%。根据氨基酸序列和基因多态性，β-CN可分为13种遗传变异体，其中A1和A2是最常见的两种。A1和A2 β-CN的区别在于第67位氨基酸：A1为组氨酸（His），A2为脯氨酸（Pro）。这一差异导致A1 β-CN在胃肠道水解时更易产生β-酪啡肽-7（BCM-7），而BCM-7与乳糖不耐受、肠道功能障碍和氧化还原平衡紊乱等健康问题相关。相比之下，A2 β-CN几乎不产生BCM-7，因此被认为对人体更有利。随着A2牛奶的营养价值被广泛认可，市场上出现了掺假或污染的A2牛奶产品，因此亟需建立准确检测A1和A2 β-CN的方法。
研究流程
特征肽段的选择与合成
研究团队基于Holstein奶牛β-CN的氨基酸序列差异，选择了A1和A2 β-CN的特征肽段：A1为IHPFAQ...VSK（含His67），A2为IHPFAQ...VSK（含Pro67）。这些肽段由安徽国平药业合成，纯度>95%。
样品制备与酶解优化
- 样品来源：纯A1或A2 β-CN生乳来自基因型为A1/A1或A2/A2的Holstein奶牛，商业A2牛奶和普通灭菌牛奶购自本地零售商。
- 酪蛋白提取：通过等电点沉淀法从牛奶中分离总酪蛋白，经SDS-PAGE验证β-CN占比（A1酪蛋白粉中约38.4%，A2约34.8%）。
- 酶解条件优化：测试了不同胰蛋白酶-酪蛋白比例（1:1,250至2:25）和水解时间（4-12小时），最终确定最优条件为胰蛋白酶-酪蛋白比例1:25、37°C水解6小时。
HPLC-MS/MS方法开发与验证
- 色谱条件：采用Agilent 1290 Infinity II HPLC系统，EC-C18色谱柱（4.6×100 mm, 2.7 μm），流动相为0.1%甲酸水/乙腈梯度洗脱。
- 质谱参数：使用Agilent 6475 MS检测器，多反应监测（MRM）模式，A1和A2特征肽段的定量离子对分别为1,340.6→1,311.0和1,330.7→714.5。
- 方法验证：
- 灵敏度：A1和A2的检测限（LOD）分别为0.01 mg/L和0.03 mg/L，定量限（LOQ）为0.03 mg/L和0.1 mg/L。
- 线性：在0.1-10.0 mg/L范围内，A1和A2的线性相关系数（R²）分别为0.9994和0.9992。
- 回收率与精密度：低浓度（0.04 g/kg）下A1和A2的回收率较高（151%和138%），但中高浓度（0.2-1.0 g/kg）下A2回收率显著降低（69.4%-75.4%），可能与吸附或电离效率有关。
酶解效率与回归模型建立
- 水解不完全性：A1和A2 β-CN的水解度分别为12.3%和9.6%，且呈抛物线关系。
- 回归模型：基于混合酪蛋白粉的实验数据，建立了A1/A2比例的幂函数回归方程（y=1.0599x^0.6556，R²=0.9999），定量范围为A1占比10%-80%或A2占比20%-90%。
主要结果
- 方法特异性与灵敏度：HPLC-MS/MS方法能有效区分A1和A2特征肽段，且基质干扰低。
- 酶解动力学差异：A2 β-CN的水解速度先于A1，但总体水解效率较低。
- 实际应用验证：测试8种普通牛奶和5种A2商业牛奶，发现普通牛奶中A1/A2比例波动较大，而A2牛奶中A2 β-CN占比>95%，未检测到A1污染。
结论与价值
本研究建立了一种基于HPLC-MS/MS的A1和A2 β-CN定量检测方法，解决了现有技术（如FTIR、电泳）无法准确定量的问题。通过优化酶解条件和建立回归模型，显著提高了检测准确性。该方法的科学价值在于揭示了A1/A2 β-CN水解的异步性和不完全性，应用价值则为市场监管和A2牛奶真实性认证提供了可靠工具。
研究亮点
- 方法创新：首次结合胰蛋白酶水解优化与回归模型校正，解决了β-CN定量中的水解偏差问题。
- 技术优势：相比传统基因检测或光谱法，HPLC-MS/MS兼具高灵敏度和定量能力。
- 实际意义：为乳制品行业提供了A2牛奶掺假检测的标准方法，助力消费者健康与市场规范。
其他发现
研究还指出，甲酸浓度对特征肽段的电离效率影响显著，最终选择0.01%甲酸水作为流动相以平衡信号响应。此外，未使用内标肽段的原因在于其无法反映β-CN的实际水解程度，且成本较高。