本研究的主要作者包括Ruud H. Wijdeven, Sietse J. Luk, Tom A. W. Schoufour, Sabina Y. van der Zanden, Marta Cabezuelo, Mirjam H. M. Heemskerk, 以及Jacques Neefjes。他们来自荷兰莱顿大学医学中心细胞与化学生物学系、阿姆斯特丹自由大学功能基因组学系、阿姆斯特丹大学医学中心神经学系（阿尔茨海默病中心阿姆斯特丹）以及莱顿大学医学中心血液学系。这项研究于2024年发表在美国免疫学家协会旗下的学术期刊《The Journal of Immunology》（第212卷，第3期，第446-454页）。
该研究的学术背景主要聚焦于肿瘤免疫学和表观遗传学领域。主要组织相容性复合体I类（Major Histocompatibility Complex class I, MHC-I）分子在所有有核细胞表面表达，负责将细胞内蛋白（包括肿瘤、病毒来源的蛋白）降解产生的肽段呈递给CD8+ T细胞，从而启动针对感染细胞或恶性细胞的适应性免疫应答。然而，肿瘤细胞经常通过下调MHC-I的表达来逃避免疫系统的识别和杀伤，这是癌症免疫疗法（如检查点抑制剂）面临的主要挑战之一。尽管已知干扰素等因子可以调控MHC-I，且抗原加工呈递（Ag Presentation and Processing, APP）通路中的基因突变会导致MHC-I下调，但在不同肿瘤类型中，MHC-I表达的转录和表观遗传调控机制尚未完全阐明。特别是，之前的研究已经发现多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2， PRC2）在部分MHC-I低表达肿瘤中起着关键抑制作用。鉴于检查点抑制剂在黑色素瘤治疗中相对成功，而黑色素瘤也存在MHC-I下调的免疫逃逸现象，本研究旨在系统性地寻找调控黑色素瘤细胞MHC-I表达的新因子，以深入理解肿瘤免疫逃逸的机制并探索潜在的治疗靶点。
研究的具体目标是：利用全基因组CRISPR筛选技术，在人类黑色素瘤细胞系中鉴定调控MHC-I表面表达的关键基因；验证筛选出的关键因子并阐明其作用机制；探究这些因子在不同MHC-I表达水平的肿瘤细胞系中的普适性；并最终在功能上验证这些调控因子如何影响肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性。
该研究的详细工作流程包含多个相互衔接的实验阶段。首先，研究人员在人黑色素瘤细胞系Mel526中进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。他们使用了David Root和John Doench提供的Brunello文库，该文库包含了针对超过19，000个人类基因的向导RNA（guide RNA, gRNA），每个基因有4条gRNA。他们将文库病毒感染Mel526细胞，用嘌呤霉素筛选出成功转导的细胞。感染6天后，他们通过流式细胞术分选表面MHC-I表达最低的5%（但不包括完全阴性的细胞）和最高5%的细胞群体。这些分选出的细胞经过扩增后，在一周后再次使用相同的标准进行分选，以富集表型稳定的细胞。随后，他们提取基因组DNA，通过PCR扩增并测序gRNA序列，使用Pinapl-py软件分析与未分选的输入细胞群体相比，gRNA在MHC-I低表达和高表达群体中的富集情况。这一无偏见的筛选方法是发现新调控因子的关键第一步。
筛选结果验证阶段，研究团队选择了在MHC-I高表达群体中最显著富集的基因PCGF1（Polycomb group RING finger protein 1）和在低表达群体中富集的基因BAP1（BRCA1 associated protein 1）进行验证。他们为每个基因设计了两条独立的gRNA，克隆到lentiCRISPR v2载体中，并分别稳定转导到Mel526和另一株黑色素瘤细胞系MelAKR中。通过流式细胞术和蛋白质印迹（Western blot）分析，他们确认了敲除PCGF1能显著增加MHC-I的表面和总蛋白水平，而敲除BAP1则降低MHC-I表达，从而验证了筛选结果，并揭示BAP1和PCGF1在调控MHC-I表达上具有相反的作用。
为了探究PCGF1和BAP1在已知MHC-I低表达肿瘤中的作用，研究人员将目光转向了其他肿瘤类型。他们在人髓系白血病细胞系K562（经典的MHC-I低表达模型）、神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE以及尤文肉瘤细胞系A673和SK-ES-1中，同样敲除了PCGF1和BAP1。流式细胞术和Western blot结果显示，在这些MHC-I本底水平很低的肿瘤细胞中，敲除PCGF1能强烈诱导MHC-I表达的上调；而敲除BAP1即使在K562细胞中也能进一步降低其本已很低的MHC-I水平。此外，他们还发现，在用干扰素-γ（IFN-γ）刺激诱导MHC-I表达后，PCGF1和BAP1的敲除仍然能分别增强和减弱这种诱导效果，且IFN-γ本身并不改变BAP1和PCGF1的表达，表明PCGF1/BAP1通路与IFN-γ信号通路是独立并行调控MHC-I的。这一系列实验证明了PCGF1介导的MHC-I抑制在多种MHC-I低表达肿瘤中具有广泛性。
接下来，研究深入到机制层面，探究PCGF1和BAP1如何调控MHC-I的转录。通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），他们发现敲除BAP1会普遍降低所有HLA-I类基因座（HLA-A， -B， -C）以及抗原加工相关基因TAP1和TAP2的mRNA水平。而敲除PCGF1则主要特异性地上调HLA-B和HLA-C的转录，对HLA-A的影响较小（在Mel526细胞中甚至无影响），对TAP1的影响也大于TAP2。这一等位基因/基因座特异性的调控模式通过使用等位基因特异性抗体（抗HLA-A2）和基因座特异性抗体（抗HLA-B/C）的流式细胞术得到了在蛋白水平上的证实。为了直接观察表观遗传修饰的变化，他们进行了染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）实验。结果显示，在MHC-I基因的启动子区域存在组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化（H2AK119ub）修饰，这是PRC1复合物的标志性抑制性标记。在HLA-B启动子上的这种修饰水平高于HLA-A启动子，这与PCGF1对HLA-B的更强抑制作用相符。敲除BAP1增加了两个启动子上的H2AK119ub水平，而敲除PCGF1则降低了HLA-B启动子上的该修饰。此外，敲除PCGF1还伴随着另一个抑制性标记——由PRC2复合物催化产生的H3K27me3在启动子区域的减少，但活性标记H3K4me3没有变化。这些数据清晰地表明：PCGF1作为PRC1复合物的亚基，促进MHC-I基因启动子区域的H2AK119ub沉积，从而抑制转录（尤其针对HLA-B/C）；而BAP1作为去泛素化酶，移除此修饰，促进基因去抑制和表达。
鉴于PRC1和PRC2在表观遗传沉默中常协同作用，研究团队探索了这两条通路在MHC-I调控中的关系。他们在Mel526（MHC-I正常）和K562（MHC-I低）细胞中敲除了PRC2的核心组分EED。结果发现，敲除EED对Mel526细胞的MHC-I表达没有影响，但能强烈上调K562细胞的MHC-I。在K562细胞中同时敲除PCGF1和EED，其对MHC-I的上调效果是叠加的，提示在MHC-I低表达的肿瘤中，PRC1和PRC2可能通过平行的通路发挥作用。然而，当他们使用PRC2催化亚基EZH2的抑制剂Tazemetostat处理K562细胞时，MHC-I被强烈诱导，而此时再敲除PCGF1则无法进一步增加MHC-I表达。这表明，当PRC2被化学抑制时，PCGF1/PRC1的功能可能被阻断或不再独立起作用，支持了在某些情况下PRC1和PRC2以组装体形式共同介导强效基因沉默的观点。综合来看，研究人员提出了一个模型：在MHC-I表达正常的细胞中，PCGF1/PRC1介导的H2AK119ub导致MHC-I的轻度抑制；而在MHC-I低表达的肿瘤细胞中，PRC2的活性也参与进来，与PRC1协同作用，导致MHC-I的转录被强烈压制。
研究的最终环节是将分子机制与免疫学功能相联系。为了验证PCGF1和BAP1调控的MHC-I表达变化是否直接影响肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤的敏感性，他们选择了SK-ES-1尤文肉瘤细胞系进行杀伤实验。该细胞系表达HLA-A2和HLA-B7，并含有肿瘤抗原PRAME。他们用表达针对PRAME/HLA-A2或PRAME/HLA-B7的T细胞受体（TCR）的工程化T细胞与对照、PCGF1敲除或BAP1敲除的SK-ES-1细胞共培养，并使用活细胞成像系统实时监测被碘化丙啶染色的死亡细胞。结果显示，与对照细胞相比，PCGF1敲除的肿瘤细胞被T细胞杀伤的速度更快、程度更高；而BAP1敲除的细胞则对T细胞杀伤的抵抗力更强。当用IFN-γ预处理肿瘤细胞使其MHC-I高表达后，各组间的杀伤差异消失，说明MHC-I的表达水平是决定杀伤效率的关键阈值。与杀伤表型一致，T细胞的活化指标（表面CD137的表达和IFN-γ的分泌）也在与PCGF1敲除细胞共培养后升高，与BAP1敲除细胞共养后降低。这些功能实验强有力地证明了，PCGF1通过表观遗传沉默MHC-I来促进肿瘤的免疫逃逸，而BAP1则通过拮抗这一过程来维持免疫识别。
本研究的主要结论是：发现并证实了组蛋白泛素修饰酶BAP1和PCGF1是MHC-I表达的相反调控因子，从而揭示了MHC-I表达调控的一个新的表观遗传层面。PCGF1作为PRC1复合物的成员，通过催化MHC-I基因启动子（尤其是HLA-B和HLA-C）的H2AK119ub修饰来抑制其转录；而BAP1则通过去除该修饰来恢复表达。在多种MHC-I低表达的肿瘤中，PCGF1介导的抑制广泛存在。在MHC-I低表型肿瘤中，PRC1和PRC2可以平行或协同作用，实现对MHC-I的深度抑制。最重要的是，PCGF1的敲除不仅能上调MHC-I，还能恢复肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性。
该研究的科学价值在于：首先，它利用全基因组筛选这一无偏见方法，系统性地发现了调控MHC-I表达的新关键因子，将表观遗传调控机制与肿瘤免疫逃逸紧密联系起来。其次，它详细阐明了BAP1和PCGF1这一对“书写器”与“擦除器”在MHC-I位点的动态平衡调控机制，并揭示了其对不同HLA基因座的特异性偏好，深化了人们对MHC-I复杂调控网络的理解。第三，它探讨了PRC1与已知的PRC2通路在MHC-I沉默中的交互关系，提出了从“轻度抑制”到“深度沉默”的模型，为解释不同肿瘤MHC-I表达异质性提供了新视角。其应用价值则体现在为癌症免疫治疗提供了新的潜在靶点。靶向PCGF1或PRC1复合物，可能成为一种逆转肿瘤MHC-I下调、增强其免疫原性、从而提高免疫疗法（如过继性T细胞疗法或检查点抑制剂）疗效的新策略。尤其是对于那些因表观遗传沉默而导致MHC-I低表达的“冷肿瘤”，这种干预可能使其转化为对免疫治疗更敏感的“热肿瘤”。
本研究的亮点包括：第一，重要的研究发现：明确鉴定出BAP1和PCGF1是MHC-I表达的关键相反调控因子，并证实了PCGF1在多种MHC-I低表达肿瘤中的广泛抑制作用及其在免疫逃逸中的功能。第二，研究方法的创新性与系统性：结合了全基因组CRISPR筛选、多肿瘤模型验证、深入的表观遗传机制分析（ChIP-qPCR）以及最终的功能性免疫杀伤实验，形成了一个从发现、验证、机制到功能的完整证据链。第三，研究对象的特殊性：聚焦于黑色素瘤及其他难治性实体瘤（如尤文肉瘤、神经母细胞瘤），这些肿瘤的免疫逃逸机制是临床转化的关键瓶颈。第四，揭示了基因座特异性调控这一有趣现象，即PCGF1更倾向于抑制HLA-B和HLA-C，这为理解MHC-I等位基因差异调控提供了新线索。
此外，研究还通过生物信息学分析，在癌症基因组图谱（TCGA）数据中发现PRC1催化亚基RNF2的表达与黑色素瘤和肉瘤中HLA-A/B/C的表达呈负相关，且高RNF2表达与患者较差生存期相关，这从临床数据角度进一步支持了PRC1在肿瘤免疫逃逸中的潜在重要性。尽管BAP1的表达与MHC-I的直接相关性被其与M2巨噬细胞浸润等其他因素的关联所模糊，但整体数据强化了表观遗传调控在肿瘤免疫微环境塑造中的关键作用。
这项由Jacques Neefjes团队完成的研究，通过严谨的实验设计，揭示了肿瘤细胞利用PCGF1/PRC1介导的表观遗传沉默来下调MHC-I、进而逃避免疫监视的新机制，不仅增进了基础免疫学和肿瘤学的知识，也为开发新的免疫治疗联合策略奠定了重要的理论基础。