基于自降解氧化海藻酸微凝胶的快速生物制造平台，用于构建胶质母细胞瘤–脑类器官界面模型并研究早期侵袭

主要作者与研究机构： 本研究由来自多所研究机构的科研人员共同完成，主要通讯作者为悉尼大学的 Ann-Na Cho 和香港大学的 Sang Jin Lee。共同第一作者包括 Chao Liang、Henry Robert Howard、Shihui Chen 和 Won-Young Choi。其他合作者分别来自悉尼大学纳米研究所、脑与心智中心、田纳西大学健康科学中心、麦考瑞大学、德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心、高丽大学、江原国立大学、庆熙大学以及香港大学李嘉诚医学院等。该研究成果发表于 Advanced Healthcare Materials 期刊，2026 年在线发表，文献号为 e04842，DOI 为 10.1002/adhm.202504842。

研究背景： 胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是世界卫生组织分级中的 IV 级胶质瘤，属于最具侵袭性和致死性的原发性脑肿瘤之一。其核心特征是快速增殖、广泛侵袭和向周围脑实质弥漫性浸润，这使得完全手术切除极为困难，复发率极高。即便采用最大范围手术切除联合放疗和替莫唑胺化疗，患者中位生存期仍不足 15 个月。因此，早期检测、及时干预以及针对肿瘤侵袭能力的精准药物开发至关重要。然而，传统的二维单层培养乃至部分三维模型无法再现 GBM 进展中动态的肿瘤–宿主相互作用。近年来虽已引入生物材料（如水凝胶）和人脑类器官来体外模拟 GBM 行为，但这些体系通常需要数周至数月才能形成稳定的细胞组装体，且常常依赖预成型结构的人工拼接，难以模拟自然侵袭动态和尺寸不对称的真实病理关系。因此，亟需一种能够快速、可重复地再现早期 GBM 浸润及肿瘤–神经相互作用转录动态的生理相关平台。本研究旨在利用自降解的 5% 氧化海藻酸（oxidized alginate，OA）微凝胶，将近乎瞬时形成的高密度 GBM 聚集体与成熟的背侧前脑类器官（dorsal forebrain organoids，DOs）融合，构建非对称类组装体（assembloids，ASMs），从而高保真地模拟 GBM 向脑组织侵袭的早期肿瘤–宿主界面。

研究流程与实验方法： 研究流程可分为多个紧密衔接的环节。 第一步是 OA 的合成与表征。研究团队通过高碘酸钠（NaIO₄）氧化海藻酸钠引入二醛基团，制备理论氧化度为 5% 的 OA（5OA）。利用 ¹H-NMR 在约 5 ppm 处观察到新出现的半缩醛质子信号，证实氧化成功。为解决常规红外光谱无法准确定量氧化度的问题，研究采用双迹二维相关光谱（2T2D-COS）方法，以未修饰海藻酸（UA）为参考、OA 为样品，提取 1035 cm⁻¹ 处的切片光谱，并基于 1024 cm⁻¹ 处相关强度与氧化度之间的线性校准模型（r² = 0.99654），成功测定 1OA、2OA、4OA 和 5OA 样品的实际氧化度分别为 1.006%、2.042%、3.850% 和 5.102%。降解实验显示，2% 和 4% 的 5OA 微凝胶在 PBS 中 1–2 天内几乎完全降解，而在 CaCl₂ 中保持结构完整，证实其生理条件下的自降解特性适用于后续细胞自组装。 第二步是 DOs 的生成与鉴定。研究团队按照既定方案从人胚胎干细胞分化获得 DOs，并通过免疫细胞化学验证其表达 PAX6、FOXG1、TUJ1（βIII-tubulin）、MAP2、Nestin 和 Ki67，证实其具备背侧前脑身份并包含祖细胞和成熟神经元群体，为构建肿瘤–宿主相互作用模型奠定了基础。 第三步是 GBM/5OA 微凝胶的制备与细胞相容性验证。研究将 U87 MG 人胶质母细胞瘤细胞以 1.5×10⁸ cells/mL 的高密度悬浮于 2% 或 4% 的 5OA 大分子溶液中，通过注射器滴入 150 mM CaCl₂ 溶液中交联形成微凝胶。Live/Dead 实验显示，DO 单独培养和包封于 5OA 微凝胶中的 DO 均具有极高活力，证实该材料无显著细胞毒性。延时成像显示，5OA 微凝胶在培养 1 小时后开始逐步降解，24 小时内细胞自发聚集形成致密的 GBM 球体，表明该平台既支持快速基质重塑，又能促进肿瘤自主组织化。 第四步是 ASM 模型的构建。将单个 GBM/5OA 微凝胶与成熟 DO 直接接触共培养于超低吸附 96 孔板中，形成尺寸不对称的 DO-GBM ASM。活细胞时间序列成像在共培养后 1–24 小时内观察到 5OA 微凝胶明显降解，释放的单个肿瘤细胞在 DO 表面聚集。第 1 天可见 GBM 细胞在 DO 表面形成紧凑簇状结构；第 2 天出现外周扩散行为；第 3 天细胞开始主动侵入类器官实质；第 4 天展现侵袭表型，表现为肿瘤前沿密集核聚集和向宿主组织深层浸润。此外，研究还开发了更可规模化的“核–壳”式共培养方法，即将多个成熟 DO 浸入高密度 GBM/5OA 悬液中后在 CaCl₂ 中交联，在 DO 周围形成定义明确的三维“肿瘤结节”外壳，随后通过 5OA 的可调降解模拟肿瘤驱动的细胞外基质重塑。 第五步是转录组分析。研究对 GBM/5OA 球体、DO 和 ASM 进行 RNA 测序（RNA-seq），结合公共数据集 GSE248479 作为对照，利用 DESeq2 进行差异表达分析，并通过基因集富集分析（GSEA）评估通路激活情况。分析流程包括数据质控、比对、基因计数、标准化、差异表达检验和通路富集分析。 第六步是体内移植验证。研究将 GFP 标记的 GBM/5OA 构建体单独或与 DO 共培养 1 天后植入 NSG 小鼠皮下。一个月后取移植物进行大体观察、H&E 染色和免疫荧光分析，以评估 ASM 在体内的肿瘤侵袭能力和组织结构重塑情况。

主要结果： 在材料表征层面，2T2D-COS 技术成功实现了常规红外光谱无法检测的低浓度二醛基团的定量分析，线性校准模型具有极高相关系数，证明该方法可作为指纹区高灵敏化学转化探针。降解实验显示 2% 和 4% 5OA 微凝胶在生理条件下 1–2 天内完全降解，降解机制涉及二醛修饰的古洛糖醛酸残基的水解和碱催化 β-消除，为后续细胞自组装释放提供了物质基础。 在细胞层面，Live/Dead 实验证实 5OA 封包对 DO 无显著细胞毒性。GBM 细胞在 5OA 内从 1 小时开始降解起，24 小时内自发形成致密聚集体，说明该平台能快速诱导肿瘤自组织。更重要的是，与单纯 GBM/5OA 对照相比，DO 的存在显著增强了 GBM 细胞聚集和向 DO 的定向迁移，表明神经类器官来源的化学趋化或机械信号促进了肿瘤细胞聚集和极化。 在组织学层面，H&E 染色显示 ASM 中 GBM 细胞牢固黏附于 DO 表面并穿透外层组织，表现为 DO 核深染区周围出现半透明嗜酸性胞质区域，标志着活跃的黏附和侵袭性重塑。免疫荧光显示，GBM 球体中 Vimentin 广泛表达，SOX2 阳性细胞集中于中央；而在 ASM 中，Vimentin⁺/SOX2⁺ 细胞迅速在类器官边界聚集并侵入内部，侵袭前沿呈现核拥挤和空间压缩，提示机械转导通路（如 YAP/TAZ）的激活。这种特征在共培养数小时内即出现，远快于传统类器官融合法所需的 2–4 周。 在转录组层面，GBM/5OA 聚集体中与细胞黏附、极性、细胞骨架重塑和收缩性相关的基因（如 F11R、DSG2、ITGA1、ITGA5、CDC42、MYL9、ICAM1）显著上调，而与神经元分化和突触信号相关的基因（如 ROBO1、ROBO2、MAP2、DCX、TUBB3、SHANK2、CAMK2A）持续下调。ASM 相比两个亲本系统有 1177 个基因一致上调，这些基因富集于 ECM 和黏附相关功能，包括层粘连蛋白亚基（LAMB1、LAMA2、LAMA5）、基底膜组织（NID1、NID2）、整合素聚集和黏着斑信号（ITGB4、VCL、PTK2）等。GSEA 显示 ASM 相比 GBM 球体在多癌侵袭基因签名、PI3K-AKT-mTOR 通路和 TGF-β 信号中显著富集，说明与 DO 共培养驱动 GBM 转录重编程进入侵袭获得性状态。 在体内层面，皮下移植一个月后，ASM 中已无法辨别 DO 结构，取而代之的是致密堆积的 GBM 细胞团，并伴有宿主血管浸润。免疫荧光证实 SOX2⁺ 干细胞样肿瘤细胞广泛分布，EPCAM⁺ 上皮样簇散布于肿瘤实质，TUJ1⁺ 神经元突起延伸至肿瘤周围，提示宿主神经整合和肿瘤诱导的可塑性枢纽形成。这些整体结果表明，5OA 基 ASM 平台能够快速再现 GBM 侵袭中的聚集、ECM 重塑、侵袭前沿形成和转录重编程等关键标志，并具备体内转化的临床相关性。

结论与价值： 本研究成功开发了一种基于 5OA 微凝胶快速自降解特性的生物工程 ASM 平台，可在数小时至数天内再现 GBM 早期侵袭的关键事件序列，包括肿瘤细胞快速迁移与聚集、上皮–间充质转化（EMT）样改变、ECM 重塑以及 SOX2⁺/Vimentin⁺ 侵袭前沿的形成。转录组分析证实，该过程由黏附分子（如 ITGA1、ITGA5 和 LAMB1）、细胞骨架调节因子（CDC42、MYL9）以及 PI3K-AKT-mTOR 和 TGF-β 通路的上调驱动，同时伴随神经元分化程序的抑制。体内移植结果进一步验证了平台的转化相关性，显示肿瘤的大量浸润和宿主组织破坏。该平台的科学价值在于：①提供了一种可规模化、时间高效的模型，将传统类器官融合所需的数周缩短至数天，极大提高了研究效率；②通过尺寸不对称设计更真实地模拟了体内小肿瘤灶向大块脑组织侵袭的空间关系；③标准化的初始细胞密度和空间定位减少了实验变异性，优于患者来源外植体的异质性。应用价值在于：该平台可望用于早期肿瘤–微环境相互作用的机制解析、针对肿瘤初始侵袭阶段的药物筛选，以及未来结合患者来源细胞构建个体化肿瘤模型，为开发阻断 GBM 早期播散的疗法提供高通量、可重复的临床前工具。

研究亮点： 首先，方法学创新体现在利用 5OA 的自降解特性实现近乎瞬时的高密度 GBM 聚集体形成，避免了酶解或螯合剂的使用，大大缩短了实验周期。其次，研究采用了 2T2D-COS 这一先进光谱分析技术，解决了常规红外无法定量的低氧化度检测难题，并建立了高精度的线性校准模型。再次，本研究构建的核–壳式 ASM 结构通过将多个 DO 包埋于高密度 GBM/5OA 壳层中，更真实地模拟了早期肿瘤灶与脑组织的空间关系。最后，研究将体外转录组数据与体内移植结果相互印证，系统性地揭示了 GBM 与神经类器官界面处的侵袭性转录重编程和可塑性枢纽形成，为理解胶质母细胞瘤的神经侵袭机制提供了多层次的证据链。