关于CD28信号通路通过上调c-Myc促进糖酵解从而驱动多发性硬化症中炎症性T细胞反应的研究报告

本研究发表于《Cells》期刊，论文题目为“CD28 Autonomous Signaling Up-Regulates C-Myc Expression and Promotes Glycolysis Enabling Inflammatory T Cell Responses in Multiple Sclerosis”。该论文于2019年6月11日正式发表。研究的主要作者为来自意大利罗马第一大学（Sapienza University of Rome）的Martina Kunkl、来自圣卢西亚基金会IRCCS（IRCCS Santa Lucia Foundation）的Manolo Sambucci，以及同样来自罗马第一大学的通讯作者Loretta Tuosto。其他合作者还包括来自圣卡米洛-福拉尼尼医院（S. Camillo/Forlanini hospital）等机构的研究人员。

一、 学术背景与研究目标

本研究隶属于免疫学与神经免疫学交叉领域，聚焦于多发性硬化症（Multiple Sclerosis， MS）——一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病——的免疫病理机制。已知MS的发病依赖于特定炎症性T细胞亚群的扩增，这些细胞是导致组织损伤和脱髓鞘的关键效应细胞。近年来的研究证据表明，MS患者的T细胞代谢可能发生重编程。因此，识别那些协调代谢过程、从而放大MS中T细胞炎症反应的刺激性分子及相关信号通路至关重要。

CD28是T细胞活化中一个至关重要的共刺激受体。传统上认为，它与抗原呈递细胞上的B7分子结合，协同T细胞受体（TCR）信号，促进细胞因子产生、增殖和效应反应。然而，值得注意的是，人源CD28也能够独立于TCR的参与而传递信号，并在健康个体和复发缓解型多发性硬化症（RRMS）患者中诱导Th17相关促炎细胞因子和趋化因子的转录与分泌。尽管CD28在调节T细胞代谢方面的贡献已被认识到，但其作用通常是在与TCR协同激活的背景下研究的。CD28作为独立的信号单元，在调节MS中T细胞炎症功能的代谢过程中的作用，此前仍不清楚。

基于此，本研究的主要目标是：表征CD28个体信号在调节RRMS患者促炎性T细胞反应的代谢程序中的作用，并阐明其潜在的分子机制。研究旨在探索CD28独立于TCR的信号如何调控T细胞的糖酵解代谢，进而影响Th17等炎症性T细胞表型的扩增和功能，从而为理解MS的免疫病理机制和寻找新的治疗靶点提供理论基础。

二、 详细研究流程

本研究设计严谨，流程环环相扣，主要包括以下几个步骤：

1. 研究对象与样本采集：研究共纳入30名根据McDonald标准确诊、临床病程为RRMS的患者，患者年龄在28-70岁之间，病情稳定（大多数患者在最近一年内未复发），且均未接受过类固醇或免疫抑制剂治疗。作为对照，研究还招募了15名健康供者（HD）并使用了15份来自血库的健康供者血沉棕黄层。所有参与者均签署知情同意书。研究的主要实验对象是从这些参与者的外周血单个核细胞中通过阴性选择富集得到的高纯度（>95%）CD4+ T细胞。

2. CD28独立信号对糖酵解和氧化磷酸化的影响评估：这是研究的核心起点。研究人员使用激动性抗CD28抗体单独刺激（模拟CD28独立信号）来自HD和RRMS患者的CD4+ T细胞，同时设置了同型对照抗体、抗CD3抗体单独刺激、以及抗CD3与抗CD28联合刺激等对照组。刺激18小时后，使用海马（Seahorse）XFe-96细胞外通量分析仪实时测量细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解水平）和耗氧率（OCR，反映氧化磷酸化水平）。通过注射葡萄糖、寡霉素、2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）、FCCP等化合物，计算出基础糖酵解、最大糖酵解、糖酵解能力、基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力等具体代谢参数。这一步骤首次在HD和RRMS患者中系统评估了CD28独立信号对T细胞代谢状态的直接影响。

3. 糖酵解在CD28促炎功能中的必要性验证：为了确定观察到的代谢变化与功能输出的因果关系，研究人员在CD28刺激RRMS患者的CD4+ T细胞时，加入了糖酵解的特异性抑制剂2-DG。随后，通过实时定量PCR检测关键促炎细胞因子（IL-6, IL-21, IL-17A, IL-22）的mRNA表达水平。通过比较加入与未加入2-DG组细胞因子的表达差异，直接验证糖酵解代谢对于CD28信号诱导的炎症反应是否必需。

4. 代谢重编程相关分子的筛选与鉴定：接下来，研究旨在探索CD28诱导糖酵解的分子机制。首先，通过qPCR检测了多种调控糖酵解的关键酶（如HK2, ENO1, PDK1, G6PD, LDHA）和缺氧诱导因子HIF-1α的mRNA水平。然而，除LDHA和HIF-1α在mRNA层面有上调外，其他酶的变化不显著，且Western blot未能证实蛋白水平的普遍上调。因此，研究转向另一个关键代谢调节因子c-Myc。通过qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上，动态监测了CD28刺激后c-Myc的表达变化。同时，利用多色流式细胞术检测了CD28刺激对葡萄糖转运蛋白GLUT1在细胞表面表达的影响，并比较了RRMS患者与HD之间，以及不同T细胞亚群（Th1样、Th17样、Th0样）之间GLUT1表达的差异。

5. CD28上调c-Myc的转录机制解析：为阐明CD28信号如何上调c-Myc，研究人员进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验。他们针对c-Myc基因启动子区P2（该区是主要的转录起始点）设计了特异性引物。ChIP实验使用抗磷酸化STAT3（pSTAT3）抗体、抗RelA（NF-κB亚基）抗体以及抗RNA聚合酶II（Pol II）抗体，分别检测了在CD28刺激后，这些转录因子和转录机器在c-Myc启动子上的富集情况。此外，通过使用抗IL-6中和抗体、STAT3特异性抑制剂S31-201以及NF-κB抑制剂PS1145处理细胞，观察这些干预对CD28诱导的c-Myc蛋白表达的影响，从而在功能上验证IL-6/STAT3和NF-κB通路在其中的作用。

6. 关键上游信号介质PI3K的鉴定：CD28的胞内尾区含有YMNM基序，可募集并激活IA类磷脂酰肌醇3-激酶（Class 1a PI3K）。为了确定IA类PI3K是否是CD28诱导代谢重编程和炎症反应的上游关键介质，研究人员在CD28刺激RRMS患者CD4+ T细胞的同时，使用了特异性的IA类PI3K抑制剂AS605240。随后，系统评估了该抑制剂对以下指标的影响：① 海马分析测得的糖酵解水平；② 流式细胞术检测的GLUT1及活化标志物（CD69， CD71， CD25）的表达；③ qPCR检测的促炎细胞因子表达；④ Western blot检测的c-Myc蛋白表达。通过这种“功能丧失”（loss-of-function）的实验策略，明确了IA类PI3K在整条信号通路中的枢纽地位。

三、 主要研究结果

1. CD28独立信号可特异性诱导CD4+ T细胞糖酵解增强，而不影响氧化磷酸化：海马分析结果显示，无论是在HD还是RRMS患者中，仅用抗CD28抗体刺激，就能显著提高CD4+ T细胞的ECAR，即增加糖酵解通量、糖酵解能力和最大糖酵解水平，其效果与抗CD3/CD28联合刺激相当。然而，OCR（氧化磷酸化水平）、最大呼吸及备用呼吸能力均未发生显著变化。这表明CD28的独立信号足以驱动T细胞的代谢向以糖酵解为主的“瓦博格效应”转换。值得注意的是，在诱导糖酵解的强度上，RRMS患者与HD之间未发现显著差异。

2. CD28诱导的糖酵解是其促炎功能所必需的：当使用2-DG抑制糖酵解后，CD28刺激在RRMS患者CD4+ T细胞中引发的IL-21、IL-17A、IL-22和IL-6等Th17相关细胞因子的mRNA上调被强烈抑制。这直接证明了CD28信号触发的代谢重编程（糖酵解增强）是其下游促炎基因表达的功能性前提。

3. CD28信号通过上调c-Myc和GLUT1驱动代谢重编程：

   • c-Myc的上调：CD28刺激能在3小时内快速诱导c-Myc的mRNA和蛋白表达达到峰值。ChIP实验证明，CD28信号能促进转录因子pSTAT3和RelA（NF-κB）结合到c-Myc基因的P2启动子区域，并伴随RNA聚合酶II的募集，表明其直接促进了c-Myc的转录激活。功能实验进一步证实，使用抗IL-6抗体中和IL-6、或使用STAT3抑制剂（S31-201）、或使用NF-κB抑制剂（PS1145），均能显著削弱CD28诱导的c-Myc蛋白表达。这揭示了CD28通过诱导IL-6自分泌，进而协同激活STAT3和NF-κB，共同驱动c-Myc表达的分子路径。
   • GLUT1的上调：流式细胞术发现，RRMS患者的CD4+ T细胞基础GLUT1表达水平高于HD。CD28刺激能进一步显著上调细胞表面GLUT1的表达，且在Th17样细胞（CXCR3-CCR6+）中上调程度最高。GLUT1作为主要的葡萄糖转运蛋白，其表达增加是细胞增强葡萄糖摄取、满足糖酵解需求的关键步骤。

4. IA类PI3K是CD28信号诱导代谢重编程和炎症反应的关键上游介质：使用IA类PI3K特异性抑制剂AS605240处理，能够全面阻断CD28信号在RRMS患者CD4+ T细胞中引发的系列效应：包括糖酵解水平的升高、GLUT1的上调、T细胞活化标志物（CD69， CD71， CD25）的表达增加、促炎细胞因子（IL-6， IL-21， IL-17A， IL-22）的mRNA水平升高，以及c-Myc蛋白的表达上调。这一结果将CD28的胞外刺激与下游的代谢及转录重编程紧密连接起来，明确了IA类PI3K在这一通路中的核心信号节点地位。

四、 研究结论与意义

本研究的结论可以概括为：在复发缓解型多发性硬化症（RRMS）中，T细胞共刺激受体CD28能够独立于TCR传递信号。该信号通过激活IA类PI3K，进而促进转录因子STAT3和NF-κB的活化，两者协同作用上调原癌基因c-Myc的表达。c-Myc作为关键的代谢调控因子，驱动葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达上调，从而增强了CD4+ T细胞的糖酵解代谢。这种代谢重编程为Th17等炎症性T细胞表型的扩增和其促炎细胞因子的产生提供了必要的能量和生物合成前体，从而放大了MS中的炎症性T细胞反应。

本研究的科学价值在于： 1. 机制创新：首次系统阐述了CD28作为独立信号单元，通过“CD28 – IA类PI3K – (IL-6)/STAT3/NF-κB – c-Myc – GLUT1 – 糖酵解 – 炎症因子产生”这条全新的轴来调控T细胞代谢和炎症功能，深化了对于共刺激信号在免疫代谢中作用的理解。 2. 疾病关联：将基础免疫代谢机制与MS的具体病理（Th17细胞异常）紧密联系起来，为解释MS中炎症T细胞的持续活化和功能亢进提供了新的代谢视角。 3. 治疗启示：研究指出，靶向CD28信号轴上的关键节点（如CD28本身、IA类PI3K、c-Myc或糖酵解过程）可能成为抑制MS中异常免疫反应的新策略。论文结尾特别提到，基因组学研究已发现MYC基因的某个单核苷酸多态性与MS风险相关，这进一步支持了靶向c-Myc通路在MS治疗中的潜在价值。

五、 研究亮点

1. 研究视角新颖：跳出传统TCR/CD28共刺激框架，专注于CD28的“自主信号”功能，发现了其在免疫代谢调控中独立且重要的作用。
2. 因果链条完整：研究从现象（糖酵解增强）到功能验证（2-DG抑制），再到分子机制探索（c-Myc、GLUT1），最后追溯到上游信号（PI3K、STAT3/NF-κB），构建了一条清晰、完整、且经过多重实验验证的信号通路。
3. 临床样本与机制研究结合：研究不仅使用了健康供者细胞，更重要的是在RRMS患者来源的原代CD4+ T细胞中验证了所有关键发现，确保了研究结论的临床相关性。
4. 技术手段综合全面：综合运用了海马细胞能量代谢分析、多色流式细胞术、qPCR、Western blot、ChIP等多种技术，从细胞功能、表型、基因转录、蛋白表达、转录因子结合等多个层面进行了深入剖析。

六、 其他有价值的内容

研究还发现，RRMS患者CD4+ T细胞的基础GLUT1水平高于健康人，且CD28刺激后GLUT1在Th17样细胞中的上调尤为显著，这提示MS患者的炎症性T细胞本身可能存在代谢“预激活”状态，对CD28等刺激更加敏感，这可能是疾病易感或持续的一个内在因素。此外，研究验证了CD28诱导的IL-6自分泌在激活STAT3中的关键作用，连接了细胞因子信号与代谢重编程，丰富了我们对免疫网络中不同信号模块互作的理解。