类型a：
西湖大学王煜棋、胡鋩泽和邹贻龙团队于2025年12月19日在期刊*Star Protocols*发表了一项关于卵巢癌多途径转移机制研究的原创性实验方案。该研究开发了一套通过体内迭代筛选高转移性卵巢癌细胞群的小鼠模型建立流程，为妇科癌症远处转移的机制研究提供了标准化操作框架。
学术背景
卵巢癌转移具有多路径（腹膜、血行、淋巴）的复杂特征，但其分子机制尚未明确。临床观察表明，约70%患者确诊时已发生广泛转移，但现有动物模型难以复现这一临床特征。传统模型多局限于腹膜扩散研究，缺乏对系统性转移的模拟能力。本研究旨在通过体内迭代筛选策略，建立能同时模拟多器官转移的卵巢癌模型，解决以下关键问题：(1) 如何获得具有高转移潜能的细胞亚群；(2) 如何定量评估不同转移路径的效率；(3) 如何建立标准化转移研究平台。
实验流程
该研究包含7个核心步骤，采用ES-2-GFP-LUC（表达绿色荧光蛋白-荧光素酶融合标记的人卵巢透明细胞癌细胞）作为研究对象，样本量每组至少10只BALB/c裸鼠：
腹膜接种
将5×10^6个ES-2-GFP-LUC细胞通过腹腔注射(i.p.)植入6-8周龄裸鼠。关键创新点在于使用胰岛素注射器(BD 320310)进行精准注射，减少操作损伤。细胞预处理采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基培养，确保细胞活性。
体内生物发光成像(BLI)
注射150 mg/kg D-荧光素钠盐(Yeasen 40901ES03)后，使用BioSpace Optima小动物成像系统监测腹膜肿瘤生长。通过M3 Vision软件定量光子数(ph/s/cm²/sr)，建立生长动力学曲线。特别优化了麻醉方案（2-3%异氟烷诱导，1-1.5%维持）以保持代谢稳定。
脏器转移检测
接种14天后，通过离体BLI检测肝肺转移。将组织浸泡于15 mg/mL D-荧光素溶液30分钟，使用70 μm细胞筛(Miltenyi 130-095-929)分离转移灶细胞。该步骤解决了体内BLI信号被腹腔大量细胞掩盖的技术难题。
肿瘤细胞分离
采用GentleMACS Octo解离仪配合肿瘤解离试剂盒(Miltenyi 130-095-929)进行三步酶解：酶H(200 μL)、酶R(100 μL)、酶A(25 μL)联合机械解离。程序37C_h_tdk2针对肝脏中等硬度组织优化，回收率提升40%。
流式分选
使用MA900多应用细胞分选仪(Sony)分选GFP+细胞，设置488 nm激光和3000 events/s流速。加入2%青霉素-链霉素防止分选污染，细胞存活率>90%。
迭代筛选
将首次分选的肝转移细胞(ES-2-MC1-HEP)二次接种，获得ES-2-MC2-HEP细胞系。值得注意的是，肺来源细胞(ES-2-MC1-LUNG)因腹腔再生长率低被排除，提示器官特异性适应机制。
转移效率评估
最终通过离体BLI定量计算转移穿透率(penetrance)，ES-2-MC2-HEP在肝肺的转移率接近100%，证实筛选有效性。
主要结果
- 首次接种7天后即观察到广泛腹膜转移(光子计数达10^6 ph/s/cm²/sr) - 离体BLI显示14天时肝肺同步转移，H&E染色证实转移灶微环境浸润 - 二次筛选后ES-2-MC2-HEP的转移效率较亲本细胞提升8倍(p=0.0011) - 建立标准化操作时间节点：接种(2h)→监测(30min)→解离(4h)→培养(4d)→再接种(18-25d)
结论与价值
该方案首次实现卵巢癌细胞多器官转移的同步模拟，其科学价值体现在：(1) 揭示转移过程的器官趋向性差异；(2) 提供ACSL4等转移相关基因的研究平台；(3) 为抗转移药物评价建立标准化模型。应用价值在于临床前研究可缩短模型建立周期至6周，且转移效率较传统方法提高5-10倍。
研究亮点
1. 创新模型：通过迭代筛选获得能模拟临床转移特征的细胞亚群
2. 多模态监测：整合体内/离体BLI与流式分选实现精准定量
3. 标准化流程：每个步骤明确时间节点与质控参数(如酶解程序选择)
4. 转化潜力：已应用于国家自然科学基金项目(82273257)的机制研究
技术细节
- 自建pCDH-COP-GFP-LUC慢病毒载体，采用3:1:1:1质粒比例(PLP1/PLP2/PLP-VSVG)提高转染效率
- 优化D-荧光素工作浓度：体外0.15 mg/mL vs 体内150 mg/kg
- 开发肝组织特异性解离程序，较常规方法细胞回收率提升35%
该方案为卵巢癌转移研究提供了可重复、定量化的实验体系，其模块化设计也可拓展至其他腹腔恶性肿瘤研究。