本研究由四川大学华西口腔医院牙体牙髓病学国家重点实验室的Quan Tang、Lingxi Hu、Wanjing Li、Tao Qin、Xin Zheng、Xuedong Zhou、Lei Cheng、Jing Chen等研究人员，联合四川大学华西医院康复医学中心Danrong Hu、腹部肿瘤科Min Ren以及香港大学生物医学科学学院Ryohichi Sugimura共同完成。论文发表于Cancer Immunology, Immunotherapy期刊2026年第75卷，文章编号62。

研究背景方面，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占口腔恶性肿物总数的90%。传统治疗手段包括手术、放疗和化疗，但口腔癌的5年总生存率仅为50%至64%，超过三分之二的患者在治疗后会出现复发，这推动了基因治疗和免疫治疗等新型治疗策略的快速发展。CD47是一种在正常细胞表面广泛表达但在多种肿瘤细胞上过度表达的糖蛋白，通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（signal regulatory protein α, SIRPα）相互作用，传递“别吃我”（“don’t eat me”）信号，使肿瘤细胞得以逃避巨噬细胞的吞噬。虽然CD47阻断疗法在多种恶性肿瘤中展现出应用前景，但单独使用CD47阻断在实体瘤模型中难以激发足够的抗肿瘤免疫反应，原因在于实体瘤微环境中巨噬细胞功能受到显著抑制，同时细胞外基质（extracellular matrix, ECM）形成的物理屏障阻碍了巨噬细胞与肿瘤细胞的接触。光热疗法（photothermal therapy, PTT）是一种利用外源性光敏剂在近红外光（near-infrared light, NIR）照射下产生热效应来消融组织的新型治疗策略，已被证明能够诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），其特征包括钙网蛋白（calreticulin, CRT）从内质网迁移至细胞膜表面，作为“吃我”（“eat me”）信号增强巨噬细胞的吞噬作用。基于上述背景，本研究旨在评估PTT与CD47阻断联合应用在OSCC中的协同抗肿瘤效果，并阐明其潜在机制。

研究的具体流程包括体外实验、体内动物实验以及机制探究三个主要层面。在体外实验部分，研究者使用了多种细胞系，包括CAL27、SCC25、SAS、SACC83、SW480和HEK293T等人源细胞，培养于含5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中；DLD1和THP1细胞则培养于RPMI-1640培养基中。通过慢病毒转染生成了表达GFP-荧光素酶融合蛋白的CAL27细胞以及表达RFP的CAL27细胞。所有细胞均置于37°C、5% CO₂的培养箱中培养。体外PTT使用吲哚菁绿（indocyanine green, ICG）作为光敏剂，将100 μg/ml ICG加入细胞培养液中，用808 nm近红外激光发射器以0.5 W的激光强度照射细胞。温度通过可视化红外温度计监测。小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）取自6至8周龄C57BL/6小鼠的双侧髂骨、股骨和胫骨，经ACK裂解液去除红细胞后，在含10 ng/ml M-CSF的完全RPMI培养基中培养7至14天。体外吞噬实验分为短期和长期两种。短期实验中，经热处理的肿瘤细胞与BMDMs以2:1比例共培养2小时，使用或不使用2 μg/ml抗人CD47抗体，BMDMs以APC偶联抗小鼠F4/80抗体标记，通过流式细胞术检测吞噬指数。长期实验中，8×10⁴个BMDMs预先接种于96孔板，肿瘤细胞经不同时间热处理后与BMDMs以3:2比例共培养24小时，通过荧光素酶发光检测存活肿瘤细胞数量来计算吞噬指数。ICD标志物检测方面，收集2×10⁶个细胞经10分钟热处理后接种于12孔板继续培养4小时，分别收集上清和细胞裂解液，使用ATP检测试剂盒测定上清中的ATP含量；通过Western blot检测上清和细胞裂解液中的HMGB1水平；CRT暴露检测则通过免疫荧光和流式细胞术两种方法进行。巨噬细胞极化检测采用qPCR方法，将经热处理的肿瘤细胞培养上清用于处理BMDMs 24小时，提取总RNA后进行逆转录和定量PCR分析。共定位实验使用表达RFP的CAL27细胞，与BMDMs共培养后通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）检测CRT阳性肿瘤细胞与CD45阳性巨噬细胞的空间关系。在体内动物实验部分，将4×10⁶个CAL-27细胞悬浮于含15% Matrigel的100 μl PBS中，皮下注射至6至8周龄BALB/c裸鼠。当平均肿瘤体积达到50 mm³时，将小鼠随机分为4组，每组5只。对照组瘤内注射PBS，aCD47组瘤内注射50 μg抗人CD47抗体，PTT组瘤内注射100 μg/ml ICG后用808 nm近红外光照射8分钟以维持局部温度在50°C左右，联合组在PTT处理后24小时给予抗体。每2天测量肿瘤大小和小鼠体重，肿瘤体积按宽度²×长度×0.5计算。实验终点为最大肿瘤体积达到500 mm³。肿瘤组织和器官经取材后进行免疫荧光和免疫组化分析。RNA测序方面，取3只小鼠的肿瘤组织进行转录组测序，差异表达基因以校正后P值<0.05且|log2倍数变化|≥1为标准筛选，随后进行KEGG通路富集分析。统计方法采用Student’s t检验或单因素方差分析，P<0.05视为具有统计学意义。

研究结果显示，在体外实验中，单独PTT组的吞噬率基本保持不变，CD47阻断组显著提高了吞噬作用，而联合组展现出最大的吞噬效果。长期实验中，肿瘤细胞与巨噬细胞共培养24小时后基础细胞存活率为73.3%，CD47阻断组降至28.3%，联合组仅有5.7%的细胞存活。体内实验中，单独PTT在47°C局部治疗温度下不足以直接消融肿瘤，CD47阻断可产生一定的抗肿瘤效果，而联合治疗组实现了显著的肿瘤抑制。组织学评估和体重监测显示治疗未引起明显毒副作用。ICD诱导方面，口腔肿瘤细胞经6分钟热处理后24小时存活率维持在80%左右，即使延长至10分钟仍有40%至50%的细胞存活，表明中等温度PTT的直接杀伤作用有限。但PTT处理后肿瘤细胞上清中ATP水平升高，Western blot检测到HMGB1的释放，免疫荧光证实CRT仅在ICG加激光组出现细胞表面暴露。机制探究发现，PTT处理后的肿瘤细胞上清液处理巨噬细胞并未引起极化相关标志物的显著变化，也未增强巨噬细胞的吞噬功能。然而流式细胞术显示CRT不仅出现在死亡细胞表面，也出现在存活细胞表面。免疫荧光共定位显示巨噬细胞更多地附着于表达CRT的肿瘤细胞。体内免疫荧光分析证实PTT显著上调了CRT的表面暴露，CRT与F4/80存在明显共定位，且PTT组F4/80表达上调，提示巨噬细胞浸润增强。RNA-seq分析显示差异表达基因最显著富集于ECM-受体相互作用通路，其中以COL1A1为代表的7个基因在PTT处理后显著下调。免疫组化染色确认I型胶原蛋白在PTT组显著降低。免疫荧光切片显示在胶原蛋白I表达较低的区域检测到更多的F4/80阳性巨噬细胞。

本研究的核心结论是，PTT通过诱导CRT暴露提供“吃我”信号，同时通过下调ECM成分促进巨噬细胞向肿瘤内的浸润，从而与CD47阻断产生协同作用。这一联合策略从三个层面发挥作用：通过CD47阻断削弱“别吃我”信号，通过CRT转位提供“吃我”信号，通过ECM调控促进“靠近我”信号。研究为口腔鳞状细胞癌提供了一种以巨噬细胞为中心的光热-免疫联合治疗策略，具有重要的临床转化潜力。研究的亮点在于揭示了中等温度PTT虽然直接杀伤肿瘤能力有限，但能够通过重塑肿瘤微环境的物理屏障来增强免疫治疗的效果，拓展了PTT在免疫治疗中的应用价值。此外，研究还证实CRT暴露不仅发生在死亡细胞上，也出现在存活肿瘤细胞表面，这一发现为理解PTT介导的免疫激活机制提供了新的视角。