一项针对费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病的新型细胞免疫疗法研究
本研究的主要作者为Patrizia Comoli和Sabrina Basso，他们分别来自意大利帕维亚的IRCCS Policlinico San Matteo的儿科血液学/肿瘤学部门和细胞工厂。其他重要合作者包括来自摩德纳和雷焦艾米利亚大学血液学部门的Giovanni Riva、Mario Luppi和Leonardo Potenza等人。该研究发表于2017年2月2日的《血液》（*Blood*）期刊，第129卷第5期，页码582-586。
一、 研究背景与目的
本研究属于血液肿瘤免疫治疗领域，具体聚焦于费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Philadelphia chromosome–positive acute lymphoblastic leukemia， Ph+ ALL）的过继性T细胞疗法（Adoptive T-cell Therapy）。Ph+ ALL曾是一种预后极差的恶性血液病。尽管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine-kinase Inhibitors， TKIs）和异基因造血干细胞移植（Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation， allo-HSCT）的应用显著改善了患者的缓解率和生存期，但高龄患者（常不适合移植）和移植后复发患者的预后仍然严峻。既往研究，包括本研究团队之前的工作，发现在接受TKI维持治疗的Ph+ ALL患者骨髓中，会出现针对白血病特异性抗原——p190 BCR-ABL融合蛋白的T淋巴细胞，并且这些细胞的涌现与患者获得血液学和细胞遗传学缓解相关。这提示了机体自身的免疫系统可能在TKI治疗背景下协同控制白血病。
基于此背景，本研究旨在探索一种全新的、靶向BCR-ABL融合蛋白的过继性T细胞免疫治疗策略。具体研究目标包括：第一，验证在体外利用BCR-ABL来源的多肽刺激，从Ph+ ALL患者或健康供者体内扩增/激活出具有抗白血病活性的、临床级别的BCR-ABL特异性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes， CTLs）的可行性。第二，以同情用药（compassionate basis）的方式，将这些体外制备的CTLs回输给难治/复发的Ph+ ALL患者（包括移植后复发和不适合移植的患者），评估其安全性和初步疗效。第三，通过监测患者治疗后的分子学反应和免疫学变化，探究该疗法的潜在作用机制。
二、 详细研究流程与方法
本研究是一项探索性临床研究，整合了体外细胞制备、临床治疗和严格的实验室监测。其详细工作流程如下：
1. 研究对象与细胞来源： 研究纳入了3例Ph+ ALL患者。 * 患者1： 61岁男性，在接受无关供者（Matched Unrelated Donor， MUD）异基因造血干细胞移植后出现第二次分子学复发。 * 患者2： 30岁男性，诊断时伴有高白细胞计数和中枢神经系统（Central Nervous System， CNS）受累，在MUD-HSCT后出现第三次血液学复发（骨髓原始细胞66%，伴有F317L突变）。 * 患者3： 62岁女性，诊断时伴有CNS受累，在经过诱导、维持化疗和长期TKI治疗后仍持续存在分子学疾病（微小残留病Minimal Residual Disease， MRD水平为0.1%），因合并症不适合进行allo-HSCT。 用于制备CTLs的细胞来源有两种：对于患者1和2，CTLs来自他们各自的造血干细胞移植供者（即异体来源）；对于患者3，CTLs来自患者自身（即自体来源）。研究从这些供者或患者的外周血中采集单个核细胞（Mononuclear Cells， MNCs）作为起始材料。
2. BCR-ABL特异性CTLs的制备与体外表征（关键实验流程）： 这是本研究的技术核心。研究团队开发了一套制备临床级BCR-ABL特异性CTLs的方案。 * 抗原刺激： 使用树突状细胞（Dendritic Cells， DCs）作为抗原提呈细胞。这些DCs被一组预先合成的p190 BCR-ABL多肽“脉冲”（即负载）。这些多肽池的设计具有新颖性：不仅包含了跨越BCR-ABL连接区（junctional region）的9肽和10肽，还包含了来源于BCR-ABL选择性剪接（alternative splicing）变异体衍生的9肽（文中称为mix3）。使用剪接变异体来源的肽段是基于先前研究，认为这些蛋白是潜在的白血病特异性抗原。 * 体外扩增与激活： 将从供者或患者血液中分离的MNCs与上述负载了多肽的DCs共培养，同时使用稳态细胞因子（文章未具体指明，但此类培养常用IL-2、IL-7、IL-15等）来促进抗原特异性T细胞的扩增和存活。整个扩增过程持续约40天，期间进行细胞计数以监控扩增情况。 * CTLs的体外功能与表型检测（质量控制）： 在细胞回输前，对制备的CTL细胞系进行了一系列严格的体外测试，以确保其特异性和活性。 * 表型分析： 通过流式细胞术检测CTLs的细胞亚群组成，包括CD3+、CD4+、CD8+、CD56+细胞的比例，以及CD4+和CD8+ T细胞中效应记忆（CD45RA-）和中央记忆（CD45RO+）亚群的比例。结果显示，所有CTL细胞系均为多克隆，包含CD3+CD8+和CD3+CD4+ T细胞。 * 免疫反应性检测（酶联免疫斑点法， ELISPOT）： 用不同的BCR-ABL多肽池（内部连接区肽、外部连接区肽、剪接变异体肽）分别刺激CTLs，检测其分泌干扰素-γ（IFN-γ）的能力，以确定CTLs对哪些抗原表位有反应。结果显示，所有CTL细胞系至少对一个多肽池产生IFN-γ反应，且均能识别mix3（剪接变异体来源）肽段。 * 细胞毒性活性检测（杀伤实验）： 这是最关键的功能验证。将CTLs与不同的靶细胞共培养，评估其杀伤能力。靶细胞包括：①负载了BCR-ABL多肽的自体植物血凝素（Phytohemagglutinin， PHA）激活的母细胞（作为抗原特异性靶标）；②患者自身的白血病原始细胞（仅对患者2的样本进行了测试）；③未负载多肽的自体或异体PHA母细胞（作为阴性对照）；④P815细胞系（用于检测非MHC限制性杀伤，如NK细胞活性）。实验设置了不同的效靶比（Effector-to-Target ratio， E:T ratio， 如20:1， 10:1， 5:1， 2:1， 0.1:1）和不同的孵育时间（5小时和12小时）。12小时的杀伤实验可用于评估HLA II类分子限制的CD4+ T细胞毒性。结果证实，制备的CTLs能够特异性杀伤负载BCR-ABL多肽的自体靶细胞和患者白血病细胞，而对未负载抗原的自体或异体靶细胞杀伤作用很弱，证明了其抗原特异性和较低的非特异性毒性。
3. 临床治疗与监测方案： * 细胞回输： 制备好的CTLs以剂量递增的方式（起始剂量较低，后续根据耐受性增加）每月一次静脉回输给患者。3名患者平均接受了10次输注（范围6-13次）。治疗在伦理委员会批准下以同情用药形式进行。 * 联合治疗： 所有患者在CTL治疗期间均继续接受TKI治疗（伊马替尼、尼洛替尼或普纳替尼）。 * 安全性与疗效监测： * 安全性： 密切监测输注相关反应及任何不良事件。 * 疗效（分子学与血液学）： 在基线期和每次CTL输注后，定期采集患者骨髓样本，通过定量逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction）高灵敏度地测量BCR-ABL转录本水平，以此量化MRD，定义分子学完全缓解（Molecular Complete Remission， MCR）或血液学完全缓解（Hematologic Complete Remission， HCR）。 * 免疫学监测（机制探索）： 这是本研究的一大特色。研究团队利用多参数流式细胞术，纵向（即随时间点多次）分析患者骨髓中是否存在以及有多少能够针对p190 BCR-ABL多肽产生细胞因子（IFN-γ、白细胞介素-2 IL-2、肿瘤坏死因子-α TNF-α）的CD4+和CD8+ T细胞。同时，还分析了这些抗原特异性T细胞的记忆表型（效应记忆型或中央记忆型）。此外，还监测了供者嵌合状态（针对移植后患者）和是否出现对其他肿瘤抗原（如WT-1）的“表位扩散”（epitope spreading）现象。
三、 主要研究结果
本研究的结果清晰地展示了从细胞制备、临床输注到产生疗效和免疫应答的完整链条。
1. CTLs制备成功并具备体外抗白血病活性： 如方法部分所述，成功从患者和健康供者体内扩增出了临床数量的BCR-ABL特异性CTLs（图1a）。这些细胞是多克隆的，包含CD4+和CD8+ T细胞（图1b），能够被BCR-ABL多肽激活并产生IFN-γ（图1c）。最关键的证据是体外杀伤实验：CTLs能高效、特异地杀伤负载了BCR-ABL抗原的靶细胞以及患者自身的白血病细胞，而对未负载抗原的正常细胞杀伤作用微弱，证明了其治疗潜力且脱靶（off-tumor）风险较低（图1d， e）。特别值得注意的是，从健康供者体内也能成功激活出BCR-ABL特异性反应，这为使用供者来源的CTLs治疗移植后复发患者提供了直接依据。
2. 临床治疗安全有效： * 安全性： CTL输注耐受性良好。未观察到立即的输注相关反应，也未发生2-4级的细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome）或其他归因于T细胞输注的严重毒性。唯一的毒性事件是患者2（血液学复发）在接受第2剂量水平的CTL输注后出现了II级皮肤移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease， GVHD），经局部激素治疗成功控制。这表明异体CTL治疗可能带来GVHD风险，但在此研究中程度可控。 * 疗效： 三名患者均获得了深度缓解。 * 患者1（移植后分子学复发）： 在接受供者来源CTL治疗4周后，达到了MCR。在为期12个月的每月CTL输注（联合伊马替尼）维持治疗期间，持续保持MCR。停止CTL治疗后，在长达57个月的随访中仍维持MCR（图2a）。 * 患者2（移植后血液学复发，骨髓原始细胞高达66%）： 这是最具挑战性的病例。在单独使用CTL治疗（尚未联合普纳替尼）的阶段，仅靠CTL输注就将其骨髓原始细胞比例从66%降至25%，显示了CTLs的单药活性。随后在CTL联合普纳替尼的治疗下，经过6次较低剂量的CTL输注，最终获得了HCR（图2b）。 * 患者3（不适合移植的持续MRD阳性患者）： 在接受自体CTL治疗16个月后，达到了MCR（图2c）。
3. 免疫学监测揭示疗效关联机制： 这是连接体外细胞制备与体内临床疗效的关键环节，结果具有高度说服力。 * 抗原特异性T细胞的体内涌现与疾病清除同步： 在所有三名患者治疗前的骨髓中，均未检测到BCR-ABL特异性T细胞。随着CTL的输注，患者骨髓中逐渐出现了能够针对p190 BCR-ABL多肽产生多种细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）的CD4+和CD8+ T细胞（图2）。这些多功能的抗原特异性T细胞在骨髓中的频率上升，与患者骨髓中BCR-ABL转录本水平（MRD）的下降乃至清零在时间点上完全吻合。 * 表位扩散现象： 在患者骨髓中还观察到了针对其他白血病相关抗原（如WT-1）的T细胞反应，这被称为“表位扩散”。这可能是由于CTL杀伤白血病细胞后，释放了更多的肿瘤抗原，进一步激活了机体更广泛的抗肿瘤免疫，这有助于实现更持久的免疫监视。
四、 研究结论与意义
本研究得出结论：利用BCR-ABL连接区及选择性剪接变异体来源的多肽，可以从Ph+ ALL患者及健康供者体内成功体外扩增/激活出具有抗白血病活性的临床级特异性CTLs。将这些CTLs过继性回输给接受TKI治疗的难治/复发性Ph+ ALL患者，具有良好的安全性和令人鼓舞的疗效，能够诱导分子学或血液学完全缓解。其体内疗效与骨髓中BCR-ABL特异性T细胞的重新出现密切相关。
本研究的价值体现在多个层面： * 科学价值： 首次在临床实践中证实了BCR-ABL可作为有效的免疫治疗靶点，并且通过体外制备特异性CTLs进行过继回输，能够在体内有效控制甚至清除Ph+ ALL。这为理解TKI治疗背景下免疫系统的作用提供了新的临床证据，并证实了将靶向治疗与免疫治疗相结合的可行性。 * 应用价值： 为Ph+ ALL患者，特别是那些不适合移植、移植后复发或对现有疗法耐药的患者，提供了一种新的潜在治疗选择。这种疗法不同于目前火热的CAR-T细胞疗法，它利用的是天然T细胞受体（TCR）识别经MHC分子提呈的肿瘤抗原肽，理论上可能具有不同的安全性和耐药谱。 * 观点与方向： 研究者提出，BCR-ABL特异性CTLs可作为CAR-T细胞疗法的一种有价值的替代或补充方案，尤其适用于无法接受或经历CAR-T严重副作用的患者，或移植后MRD持续阳性的患者。此外，研究者展望了未来将该疗法与免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors）或双特异性T细胞衔接器（如Blinatumomab）联合的可能性，以克服T细胞耗竭，延长CTLs的体内持久性，从而进一步增强疗效。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究在讨论部分进行了审慎而前瞻性的分析。作者比较了该TCR-T细胞疗法与CAR-T细胞疗法的潜在优劣，指出CAR-T疗法虽然效果显著，但存在细胞因子释放综合征和“脱靶/离瘤”毒性等风险。相比之下，BCR-ABL特异性CTLs基于天然TCR识别，可能具有不同的安全性特征。同时，作者也承认TKI药物可能对免疫效应细胞功能存在影响，但本研究及先前证据表明，在长期TKI治疗下，免疫系统仍具功能并可被调动。这些讨论为领域内研究者提供了重要的思考维度。