本研究由广州中医药大学第二临床医学院（the second clinical college of guangzhou university of chinese medicine）的周畅（chang zhou）和赵元奇（yuan-qi zhao）等人完成，发表于 Phytomedicine 期刊2026年第153卷，文章编号157887。研究团队主要来自广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医院（guangdong provincial hospital of chinese medicine）及广东省中医药科学院（guangdong provincial academy of chinese medical sciences）。
缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）是全球范围内造成重大健康负担的疾病。目前临床治疗主要依赖静脉溶栓和血管内取栓来快速恢复血流再灌注，但脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI）引起的梗死快速进展等不良后果仍缺乏有效干预手段。神经炎症在CIRI中扮演关键角色，而小胶质细胞（microglia）作为中枢神经系统常驻免疫细胞，其焦亡（pyroptosis）被证实可促进急性脑缺血损伤。
焦亡是一种由gasdermin家族介导的程序性细胞死亡形式，主要由gasdermin D（GSDMD）执行。GSDMD被caspase-1（经典途径）或caspase-11（非经典途径）切割后形成膜孔，导致细胞内容物释放及白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18的成熟释放，放大神经炎症。近年来新发现的一种促炎性细胞死亡形式——细胞外陷阱死亡（extracellular trap death, etosis）与GSDMD密切相关。etosis最初在中性粒细胞中被发现（称为NETosis），其特征是染色质释放到细胞外形成网状结构，伴随瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3, CitH3）等标志物表达。后续研究表明，小胶质细胞、星形胶质细胞等也可发生etosis。GSDMD可能作为连接焦亡与etosis的分子执行器，但CIRI中关于小胶质细胞etosis的研究仍然有限。
醒脑升降散（xing-nao-sheng-jiang powder, XNSJP）是研究团队在清代经典方剂“升降散”基础上改良而来的中药复方，由三桠苦（evodia lepta merr.）、红花（carthamus tinctorius l.）、羌活（hansenia weberbaueriana）、姜黄（curcuma longa l.）、大黄（rheum palmatum l.）、蝉蜕（cryptotympana pustulata fabricius）和僵蚕（bombyx mori linnaeus）七味药组成。前期研究表明升降散可通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制CIRI中的小胶质细胞焦亡。本研究旨在验证XNSJP能否通过靶向抑制GSDMD来抑制焦亡相关的etosis，从而减轻CIRI中的神经炎症。
本研究分为三个阶段，实验对象为SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250–280 g，共使用177只。CIRI模型采用经典的短暂性大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）方法建立。
第一阶段：观察低、中、高剂量XNSJP对神经功能和梗死面积的影响以确定最佳剂量。33只大鼠随机分为7组：假手术组（sham, n=3）、缺血再灌注组（I/R, n=5）、XNSJP低剂量组（XNSJP-L, 2.925 g·kg⁻¹·d⁻¹, n=5）、XNSJP中剂量组（XNSJP-M, 5.85 g·kg⁻¹·d⁻¹, n=5）、XNSJP高剂量组（XNSJP-H, 11.7 g·kg⁻¹·d⁻¹, n=5）、GSDMD抑制剂双硫仑组（DSL, 500 mg·kg⁻¹·d⁻¹, n=5）及阳性药丁苯酞组（NBP, 60 mg·kg⁻¹·d⁻¹, n=5）。通过Zea-Longa神经功能评分和2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色评估神经功能缺损和脑梗死面积。
第二阶段：验证XNSJP的长期疗效并探索小胶质细胞etosis的时间变化趋势。设立sham（n=15）、I/R-3d（n=6）、I/R-7d（n=18）、XNSJP-H-7d（n=18）和DSL-7d（n=18）组，共75只大鼠。通过免疫荧光多重染色计数IBA-1⁺/GSDMD⁺/CitH3⁺小胶质细胞，以及Western blot检测etosis标志物（CitH3、MPO、PAD4）和焦亡标志物（GSDMD-NT、caspase-11、caspase-1 p20/p10）的表达。
第三阶段：验证XNSJP抑制etosis和减轻炎症损伤的机制。69只大鼠随机分为sham（n=15）、I/R（n=18）、DSL（n=18）和XNSJP-H（n=18）组，药物于术前3天开始给予，持续至再灌注后24 h处死。检测方法包括：Western blot检测焦亡通路蛋白（NLRP3、caspase-1、caspase-11、GSDMD）和etosis通路蛋白（CitH3、PAD4、MPO、Rac3）的表达；多重免疫荧光共定位分析IBA-1⁺/MPO⁺/caspase-1⁺小胶质细胞和IBA-1⁺/GSDMD⁺/CitH3⁺小胶质细胞；透射电子显微镜（TEM）观察小胶质细胞超微结构；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血清中CitH3、IL-1α、IL-18、IL-1β和游离DNA（cfDNA）水平。
此外，研究还采用超高效液相色谱（UPLC）对XNSJP的主要成分进行特征图谱分析，利用串联质谱（MS/MS）和网络药理学方法进行代谢物鉴定、靶点预测和通路富集分析。
UPLC与代谢组学分析：UPLC鉴定出XNSJP的13个特征峰，其中峰1为没食子酸（gallic acid），峰9为大黄素单葡萄糖苷（emodin monoglucoside），峰13为大黄酚（chrysophanol）。血清代谢组学显示XNSJP组与I/R组共享694种代谢物，XNSJP显著上调257种、下调31种代谢物，其中黄酮类、酚酸类、生物碱类等明显增加。值得注意的是，XNSJP血清中丁苯酞（butylphthalide）水平显著升高，尽管XNSJP并非来自芹菜（丁苯酞的原始来源），推测红花和羌活可能是其来源。网络药理学分析表明XNSJP靶向Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路及补体与凝血级联等，提示XNSJP可调控动脉粥样硬化、凝血和炎症等多个与脑缺血相关的病理过程。
XNSJP减少脑梗死面积：TTC染色显示，与假手术组相比，I/R组梗死面积显著增大（p<0.01）；高剂量XNSJP（XNSJP-H）可显著减小24 h后的梗死面积（p<0.01），DSL组和NBP组也表现出类似效果。长期疗效方面，XNSJP-H和DSL在CIRI后7 d仍能减少梗死面积（p<0.01）。Nissl染色显示，24 h和7 d后XNSJP-H和DSL均能减少梗死边缘区神经元固缩数量。
小胶质细胞etosis在CIRI后24 h显著激活：免疫荧光计数显示IBA-1⁺/GSDMD⁺/CitH3⁺小胶质细胞在I/R-24 h组显著高于3 d和7 d组。Western blot证实etosis标志物（CitH3、MPO、PAD4）和焦亡标志物（GSDMD-NT、caspase-11、caspase-1 p20/p10）在24 h时均显著升高，因此选择24 h作为观察XNSJP药理作用的时间点。
小胶质细胞是CIRI后24 h缺血半暗带etosis的关键贡献者：免疫荧光显示中性粒细胞标志物Ly6G主要表达于血管内及血管周围，脑实质内浸润极少；而IBA-1⁺/MPO⁺/caspase-1⁺小胶质细胞在I/R组梗死核心区显著增加（p<0.01），DSL和XNSJP组均显著减少（p<0.01）。这一结果颠覆了传统认为急性缺血性脑卒中etosis主要由外周浸润的中性粒细胞介导的观点，提出etosis主要由脑实质内在神经细胞（尤其是小胶质细胞）驱动的新范式。此外，小胶质细胞焦亡与etosis存在共定位，且焦亡抑制剂可抑制二者的表达，提示小胶质细胞焦亡可能参与细胞外陷阱的释放。
XNSJP抑制caspase-1/11/GSDMD介导的焦亡通路：Western blot结果显示，与I/R组相比，DSL组和XNSJP组的GSDMD-NT表达显著降低（p<0.05），caspase-1 p20和caspase-11切割端表达也显著受抑（p<0.05），但NLRP3表达在各组间无显著差异，提示XNSJP并非通过NLRP3炎症小体发挥作用。
XNSJP对小胶质细胞etosis的抑制作用与GSDMD密切相关：WB显示XNSJP显著降低CitH3、PAD4和MPO的表达（p<0.05），但Rac3无显著变化。多重免疫荧光证实IBA-1⁺/GSDMD⁺/CitH3⁺小胶质细胞在I/R组显著增多（p<0.01），DSL和XNSJP组显著减少（p<0.01）。TEM观察到I/R组小胶质细胞膜皱缩破裂、线粒体嵴溶解，并可见细胞外网状结构（etosis的形态学标志）；DSL组和XNSJP-H组损伤程度明显减轻。
XNSJP抑制小胶质细胞焦亡与etosis下游炎症因子：XNSJP可降低脑组织IL-1β表达（p<0.05），显著抑制外周血清CitH3水平（p<0.01），并降低CitH3/cfDNA比值（p<0.01），但对IL-1α和IL-18的影响未达统计学显著性。
本研究首次在CIRI模型中证实小胶质细胞etosis是缺血半暗带中一种关键的、此前被低估的细胞死亡形式。XNSJP通过抑制GSDMD激活，同时抑制caspase-1/11/GSDMD介导的小胶质细胞焦亡和MPO/PAD4/CitH3介导的小胶质细胞etosis，从而减轻超早期CIRI的神经炎症损伤，减小梗死体积。研究将CitH3重新定义为广义etosis标志物而非仅限NETosis，提出了靶向GSDMD调控中枢免疫细胞etosis的新策略，为缺血性脑卒中的治疗提供了新的药物靶点和理论依据。XNSJP作为一种中药复方，其多成分、多靶点的特性使其在抗CIRI方面具有独特的临床应用潜力。
作者指出，受实验条件限制，未能进行GSDMD基因敲除验证，也未能通过流式细胞术或染色质凝集成像对小胶质细胞etosis进行更精细的定量分析。此外，GSDMD抑制如何同时下调上游MPO和PAD4活化的机制尚不明确，MPO与caspase-1/11/GSDMD信号轴之间的串扰有待未来研究阐明。