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一、研究作者、机构与发表信息
本研究由俄罗斯科学院乌法联邦研究中心的Lidia A. Baltina团队与中国医药大学（台湾）的Cheng-Wen Lin团队等合作完成，主要通讯作者为L.A. Baltina和C.-W. Lin，论文发表于 Bioorganic & Medicinal Chemistry 第41卷（2021年），文章编号116204，并于2021年5月10日在线发表。合作机构包括中国医药大学附属医院、中国医药大学医学检验生物技术学系、亚洲大学生物技术学系以及俄罗斯科学院乌法联邦研究中心石油化学与催化研究所。
二、研究背景与目的
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus genus）的一种虫媒病毒，主要通过伊蚊（Aedes sp.）传播。ZIKV感染可引起成人吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome, GBS）及胎儿小头畸形等严重神经系统并发症。目前尚无获得许可的疫苗或特异性抗病毒药物用于ZIKV感染的治疗，因此寻找和开发抗ZIKV药物具有重要的公共卫生意义。
甘草次酸（glycyrrhetinic acid, GA）是从甘草根（Glycyrrhiza glabra L. 或 Gl. uralensis Fisher）中分离得到的一种五环三萜类化合物，具有抗炎、保肝、抗癌、抗菌和抗病毒等多种生物活性。已有研究表明，GA及其衍生物对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、乙型肝炎病毒（HBV）和甲型流感病毒（H1N1）等具有抑制作用，但其抗ZIKV活性尚未被系统研究。本研究旨在合成一系列含氮和含硫的GA衍生物，并通过体外实验评价其抗ZIKV活性，筛选出具有潜在开发价值的先导化合物，并初步探讨其构效关系和可能的作用靶点。
三、研究流程与实验方法
本研究主要包括三个方面的实验流程：化学合成、体外抗病毒活性筛选和作用机制初步研究。
1. 化学合成
研究以GA（化合物1）为起始原料，合成了16个GA及结构相关三萜类衍生物，包括酰胺类、缩氨基脲类、缩氨基硫脲类和1,2,3-噻二唑类化合物。首先，通过3β-乙酰氧基-GA（化合物2）与氯化亚砜反应生成酰氯（化合物10），再与3-氨基喹啉、6-氨基喹啉、2-氨基吡啶和3-苯基-2-氨基噻唑等杂环胺反应，制得酰胺类化合物11–14。其次，利用3-氧代衍生物5–9与盐酸氨基脲在乙醇中回流反应，生成3-缩氨基脲类化合物15、16、20、21和25；与盐酸氨基硫脲反应得到3-缩氨基硫脲类化合物17和22。部分缩氨基脲类化合物通过Hurd–Mowry反应（与氯化亚砜作用）环化，得到A环稠合的1,2,3-噻二唑类化合物18、19、23和24。所有化合物的结构通过红外光谱（IR）、核磁共振氢谱（¹H NMR）、碳谱（¹³C NMR）、液质联用（LC-MS）和元素分析等方法确认。其中，化合物23的晶体结构通过X射线单晶衍射分析进一步证实，该化合物属于P2₁2₁2₁手性空间群，分子中包含五个六元碳环和一个五元杂环，噻二唑环为平面结构。
2. 细胞毒性与抗病毒活性筛选
研究使用人SF268细胞评价化合物的细胞毒性，采用MTT法测定50%细胞毒性浓度（CC₅₀）。结果显示所有GA衍生物的CC₅₀均大于50 μM，表明这些化合物的细胞毒性较低。
抗病毒活性筛选首先在10 μM浓度下进行，通过观察ZIKV诱导的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）和采用免疫荧光法检测病毒NS1蛋白的表达水平来评价化合物的抑制效果。结果表明，化合物13、16、18和19在10 μM浓度下对ZIKV诱导的CPE具有强抑制作用，并且对NS1蛋白表达的抑制率超过70%。化合物15和25表现出中等抑制活性（63%–67%），其余化合物的活性较弱。
3. 半数抑制浓度（IC₅₀）与治疗指数（TI）测定
对活性较好的化合物13、16、18和19分别在0.1、1和10 μM浓度下进行CPE减少实验、NS1蛋白翻译抑制实验和病毒感染性抑制实验。结果显示，化合物13的IC₅₀为0.13 μM，治疗指数（TI）大于384；化合物16的IC₅₀为0.55 μM（TI > 90.9）；化合物18的IC₅₀为0.29 μM（TI > 172.4）；化合物19的IC₅₀为0.56 μM（TI > 89.3）。这些结果表明四种化合物均具有显著的体外抗ZIKV活性，其中化合物13的活性最强。
4. 作用阶段分析（time-of-addition/removal assay）
为研究活性化合物抑制ZIKV感染的早期（进入阶段）和晚期（进入后阶段）作用，研究采用时间添加/移除实验。结果显示，化合物19在进入阶段的IC₅₀为0.50 μM，优于化合物13（0.68 μM）、16（1.09 μM）和18（0.52 μM）；在进入后阶段，化合物19的IC₅₀为0.43 μM，仍为最强抑制剂，化合物16的IC₅₀为0.45 μM，化合物13和18分别为1.00 μM和1.94 μM。这表明1,2,3-噻二唑环对抑制病毒进入阶段具有重要作用，而30位丁酯基团对进入后阶段有影响。
5. 分子对接分析
研究利用ZIKV NS2B-NS3蛋白酶（PDB ID: 5H6V）的晶体结构进行分子对接模拟。结果表明，化合物13和19均可结合于该蛋白酶的活性口袋。化合物13的氧原子与Ser135、Gly133和Tyr134的氢原子形成氢键；化合物19的羰基与Tyr161形成氢键，其1,2,3-噻二唑片段与His51环形成π-π堆积相互作用。配体-蛋白复合物的结合自由能（ΔGMM-GBSA）相近，表明二者与靶蛋白的结合能力相当。
四、主要研究结果
本研究成功合成了16个GA衍生物，并在体外评价了其抗ZIKV活性。主要结果包括：
所有化合物对SF268细胞的毒性均较低（CC₅₀ > 50 μM），说明其安全性较好。
在10 μM浓度下，化合物13、16、18和19对ZIKV诱导的CPE具有强抑制效果，且对NS1蛋白表达的抑制率均超过70%。这表明这些化合物能有效抑制病毒蛋白翻译和病毒复制。
剂量依赖性实验显示，化合物13的IC₅₀最低（0.13 μM），TI最高（>384），是活性最好的先导化合物。化合物18和19的IC₅₀分别为0.29 μM和0.56 μM，也表现出强效抑制活性。这些数据表明GA衍生物具有显著的体外抗ZIKV潜力。
构效关系分析表明，GA的30位和3位修饰对活性具有重要影响。含1,2,3-噻二唑环的化合物18和19在抑制病毒进入阶段作用较强，而30位丁酯基团的存在增强了化合物19对进入后阶段的抑制活性。相比之下，11-去氧-GA衍生物（如20、22、23）的活性较低，说明11位羰基对维持抗病毒活性具有重要意义。
时间添加/移除实验进一步阐明各化合物在病毒生命周期不同阶段的作用特点。化合物19在进入阶段和进入后阶段均表现出最强的抑制活性，提示其可能具有多重作用机制。
分子对接结果显示，化合物13和19能够与ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的催化三联体（His51-Asp75-Ser135）区域形成氢键或π-π堆积相互作用，表明该蛋白酶可能是其抗病毒作用的重要靶点之一。
五、研究结论与意义
本研究首次系统评价了GA衍生物对ZIKV的体外抑制活性。研究发现，16个GA衍生物中有4个化合物（13、16、18、19）具有强效的抗ZIKV活性，IC₅₀均低于1 μM，其中化合物13的IC₅₀为0.13 μM，治疗指数大于384。这些化合物在抑制ZIKV诱导的细胞病变、病毒NS1蛋白翻译和病毒感染性方面均表现出显著效果。时间添加/移除实验表明，化合物19对病毒进入和进入后阶段均有抑制作用，具有进一步开发为广谱抗ZIKV药物的潜力。分子对接分析提示NS2B-NS3蛋白酶可能是这些活性化合物的作用靶点之一。本研究为基于天然产物骨架开发新型抗ZIKV药物提供了科学依据和先导化合物。
六、研究亮点
本研究的亮点包括：首次报道GA衍生物对ZIKV的抑制活性；发现化合物13具有极低的IC₅₀和很高的治疗指数；通过构效关系分析揭示了11位羰基、30位取代基和1,2,3-噻二唑环对抗病毒活性的重要贡献；利用时间添加/移除实验区分了化合物对病毒进入和进入后阶段的不同作用效果；通过分子对接初步阐释了活性化合物与ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的可能结合模式。
七、其他有价值的贡献
研究还首次合成了11-去氧-GA的丁酯（化合物4）和3-氧代衍生物丁酯（化合物8），并报道了其波谱数据。此外，化合物23的X射线单晶结构为理解该类三萜衍生物的空间构型提供了直接证据，对后续结构优化和药物设计具有参考价值。