关于罕见错义变异WNT16和ERVW-1导致系统性红斑狼疮的全基因组测序研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由陈建海（Jianhai Chen）与张平（Ping Zhang）作为共同第一作者，吴永康（Yongkang Wu）作为通讯作者主导。研究团队主要来自四川大学华西医院的实验医学科（Department of Laboratory Medicine）以及系统遗传学研究所（Institutes for Systems Genetics）。合作单位包括武汉的生物转导实验室（Bio-transduction Lab）以及卫生部移植工程与移植免疫重点实验室（Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, Ministry of Health）。该研究成果发表于期刊《Genomics》第114卷（2022年），文章编号110332，已于2022年3月10日在线发表。这是一篇遵循CC BY-NC-ND许可的开放获取文章。
二、 研究背景与目标
本研究属于人类复杂疾病遗传学，特别是自身免疫性疾病遗传学领域，聚焦于系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）。SLE是一种慢性、潜在致命的自身免疫性疾病，以自身免疫耐受破坏、持续产生自身抗体、免疫复合物形成以及多器官系统炎症为特征。其全球患病率约为0.1%，在女性中更为常见。流行病学研究已证实SLE具有高遗传度（>66%）。
尽管全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study, GWAS）已在欧洲和东亚人群中发现了数百个与SLE相关的常见遗传变异，但这些变异通常效应值较小，且难以精确定位到致病基因，导致SLE的遗传度存在大量“缺失的遗传力”。进化理论预测，有害突变在群体中应较为罕见，因为它们受到纯化选择的作用。因此，具有较大功能效应的罕见变异可能是解释这部分缺失遗传力的关键。此前，一项基于欧洲人群的全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）研究已证实罕见变异对SLE有重要影响。然而，针对中国SLE患者，尚缺乏基于WGS的罕见变异研究。此外，SLE的发病风险存在种族差异，凸显了在不同祖先人群中全面描绘其遗传变异谱的重要性。
本研究旨在通过一项基于家庭的WGS研究，在中国SLE患者中识别具有较大效应值的新型罕见变异。研究目标包括：1）利用WGS技术对来自三个中国家庭的SLE患者及其未患病家庭成员进行测序；2）基于大规模群体频率数据（gnomAD数据库）筛选罕见、具有破坏性或序列改变效应的蛋白编码基因变异；3）评估罕见变异在患者中的遗传负荷；4）鉴定与SLE状态共分离的致病性罕见变异；5）通过生物信息学分析和体外功能实验验证候选基因变异的功能影响。
三、 详细研究流程
本研究流程严谨，整合了基因组学、生物信息学和分子生物学实验方法。
1. 样本收集与临床信息： 研究纳入了来自中国西部三个家庭的16名个体，包括7名符合美国风湿病学会（ACR）1982年诊断标准的SLE患者和9名未患病的家庭成员作为对照。所有参与者均为女性，最早发病年龄为18岁。样本采集和实验方案获得了四川大学华西医院伦理委员会的批准。
2. 全基因组测序与变异检测： 对16个样本进行了全基因组测序（Illumina HiSeq X，150 bp双端测序，平均插入片段350 bp）。使用fastp软件进行原始数据质量控制、接头修剪和过滤。将质控后的序列比对到人类参考基因组（hg38），使用BWA软件。随后，遵循GATK最佳实践流程，进行排序、标记重复序列和碱基质量值重校准。使用GATK HaplotypeCaller工具调用单核苷酸变异（SNVs）和小片段插入缺失（indels）。平均测序深度为31.89×，足以进行准确的变异检测。最终获得了超过1100万个SNV和小indel变异。
3. 遗传背景与群体结构分析： 为确保后续分析的准确性，研究首先验证了家庭关系的真实性并确定了样本的群体来源。 * 亲缘关系与近交分析： 使用PLINK软件分析所有个体的纯合片段（Runs of Homozygosity, ROH）。结果显示所有个体在常染色体上的ROH水平相似，表明不存在可检测的近交负荷，排除了常染色体隐性遗传模式的预期。 * 遗传距离聚类： 基于全基因组状态同一性（Identity by State, IBS）模型进行聚类分析，结果与家庭口头描述的关系一致，确认了家庭内成员的紧密遗传关系，并推断其中一个家庭中的双胞胎姐妹为异卵双胞胎。 * 群体主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）：将本研究样本与“千人基因组计划”中26个全球人群的数据合并进行PCA分析。结果显示所有研究样本均聚类在东亚人群内部，证实了其东亚血统。这为后续使用gnomAD数据库中东亚人群数据作为参考来定义罕见变异提供了依据。
4. 罕见变异负荷分析与候选变异筛选： * 变异分类与负荷比较： 基于gnomAD数据库v3.1的东亚人群等位基因频率数据，将变异分为罕见（MAF < 0.01）、较不常见（0.01 < MAF < 0.05）和常见（MAF > 0.05）。通过比较病例和对照之间的等位基因频率差异，将罕见变异进一步分为“病例富集”或“对照富集”。统计分析发现，SLE患者中罕见变异的遗传负荷显著高于常见变异（OR = 1.029， p < 0.0001），这与先前欧洲人群的研究结果一致。 * 候选变异识别流程： 研究设计了一套严格的生物信息学筛选流程来识别致病变异： * 影响预测与频率过滤： 使用Ensembl 变异效应预测器（Variant Effect Predictor, VEP）和SnpEff工具对变异进行注释。仅保留预测为“高”（如移码、无义突变）或“中度”（如错义突变）影响的变异。同时，筛选在gnomAD数据库中频率低于0.01或未收录的罕见变异。 * 共分离与关联分析： 使用PLINK进行病例-对照共分离分析，重点关注能解释所有或大多数病例的变异。对全基因组变异进行比值比（Odds Ratio, OR）检验，仅保留OR显著（p < 0.05）且95%置信区间下限大于1的变异。 * 多重罕见变异关联检验验证： 为验证手动筛选的结果，使用RVTests软件包进行了16种不同的罕见变异关联检验（包括单变异检验、负担检验、可变阈值模型检验和核模型检验）。
5. 候选变异的生物信息学分析： * 系统发育保守性分析： 从Ensembl数据库获取候选变异位点在灵长类物种中的直系同源序列比对，评估其进化保守性。 * 蛋白质结构预测： 对于在WNT16基因中发现的错义变异，从AlphaFold蛋白质结构数据库下载了野生型蛋白的预测三维结构。由于突变位点（第86和87位丙氨酸）的预测置信度很高，研究使用本地AlphaFold2流程预测了突变型（丙氨酸变为脯氨酸）的结构，以评估潜在的二级结构变化。 * 基因表达谱查询： 利用GTEx和HPA数据库的群体RNA-seq数据，查询了候选基因在多种组织中的表达情况。
6. 体外功能实验验证： * WNT16的荧光素酶报告基因实验： 为了测试WNT16野生型和突变型在激活经典Wnt/β-catenin信号通路中的功能差异，研究在Jurkat T细胞中进行了荧光素酶报告基因实验。将含有WNT/β-catenin通路响应元件的TOP-Flash报告质粒与不同剂量（50ng, 100ng, 150ng）的野生型或突变型WNT16表达质粒共转染Jurkat细胞。48小时后检测荧光素酶活性，并以β-半乳糖苷酶活性进行标准化。 * ERVW-1的定量PCR实验： 为了验证ERVW-1野生型和突变型对cAMP/PKA信号通路的响应差异，将野生型或突变型ERVW-1表达质粒转染Jurkat细胞。转染12小时后，加入cAMP类似物（8-Br-cAMP）进行刺激。分别在刺激后24、48、60、72小时提取RNA，通过定量PCR（qPCR）检测ERVW-1 mRNA的表达水平，并以β-actin作为内参基因进行标准化。
四、 主要研究结果
1. 测序与遗传背景确认结果： 成功获得了16个样本的高质量WGS数据，平均深度31.89×，基因组覆盖度>99%。ROH和IBS分析证实了家庭关系的准确性，并排除了近交背景。PCA分析明确将本研究的样本定位为东亚人群，验证了使用东亚人群频率数据的合理性。
2. 罕见变异负荷与候选基因鉴定结果： 遗传负荷分析显示，SLE患者中罕见变异的负担显著高于常见变异，支持了罕见变异在SLE发病机制中具有更大效应的假设。 通过严格的筛选流程，研究鉴定出两个基因（WNT16和ERVW-1）中的罕见错义变异与SLE状态高度相关： * WNT16基因： 发现一个罕见错义变异（NC_000007.14:g.121329757G>C， NP_057171.2:p.(Ala86Pro)）在三个家庭的7名患者中的5名（71.4%）存在，而在所有9名对照中均不存在。该变异的OR值为41.8（p=0.02），显示出显著的致病风险。另一个紧密连锁的错义变异（NC_000007.14:g.121329760G>C， p.(Ala87Pro)）也被发现。这两个变异在gnomAD数据库中均无记录，表明其在全球人群中极为罕见。多重罕见变异关联检验中，14/16的检验方法支持WNT16与SLE风险显著相关。 * ERVW-1基因： 在未能用WNT16变异解释的两名患者（Wu1和Wu15）以及另外两名患者中，发现了一个由三个完全连锁的罕见错义变异组成的单倍型（rs74545114, rs201142302, rs199552228）。这些变异在所有对照中均不存在。SIFT和PolyPhen工具预测其中两个变异具有有害或可能有害效应。
3. 生物信息学分析结果： * 保守性与结构预测： 多物种序列比对显示，WNT16和ERVW-1的突变位点在灵长类物种中高度保守。AlphaFold2结构预测表明，WNT16的两个突变（Ala86Pro和Ala87Pro）可能导致局部小螺旋结构的丢失，提示其可能对蛋白质功能产生重要影响。 * 表达谱： 公共数据库显示WNT16在皮肤中表达富集，这与SLE常累及皮肤的症状相符。
4. 体外功能实验结果： * WNT16功能丧失： 荧光素酶报告基因实验显示，即使低剂量（100ng）的野生型WNT16也能强烈激活经典Wnt/β-catenin信号通路（激活倍数达5.7倍），而突变型WNT16完全丧失了激活该通路的能力。 * ERVW-1功能异常： qPCR实验表明，在cAMP刺激下，野生型ERVW-1的表达在24小时和48小时显著上调，而突变型ERVW-1在这两个时间点未观察到显著上调。虽然在60小时突变型有上调，但此时野生型的刺激组与对照组已无差异。这表明所发现的ERVW-1突变体影响了其正常的cAMP/PKA信号通路响应。
五、 研究结论与意义
本研究首次通过基于家庭的全基因组测序，在中国SLE患者中鉴定出WNT16和ERVW-1基因的罕见错义变异具有致病风险，并提供了直接的遗传学和体外功能证据。 * 科学价值： 1. 发现新的SLE易感基因： 首次将WNT16和ERVW-1的罕见功能丧失变异与SLE的遗传易感性直接联系起来，为理解SLE的复杂遗传架构提供了新见解。 2. 阐明潜在致病机制： 实验证明WNT16突变导致其激活Wnt/β-catenin经典通路的功能丧失，而该通路在维持正常免疫稳态中起重要作用。这提示Wnt/β-catenin信号通路功能缺陷可能是SLE的一个致病环节。同时，ERVW-1突变影响了其对cAMP刺激的正常反应，为内源性逆转录病毒在SLE发病中的作用提供了新的分子证据。 3. 支持罕见变异假说： 研究结果支持了“罕见变异贡献于复杂疾病缺失遗传力”的假说，并强调在非欧洲人群中进行WGS研究对于发现人群特异性遗传因素的重要性。 * 应用价值： 鉴定出的WNT16和ERVW-1罕见变异可作为潜在的生物标志物，为未来开发针对特定遗传亚型SLE患者的精准疗法提供了可能的靶点。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还探讨了WNT16表达可能存在的性别差异（基于GTEx数据），并联系到SLE发病率的性别失衡现象，为未来研究性别与遗传互作提供了线索。此外，研究详细讨论了内源性逆转录病毒（ERVs）通过分子模拟和核酸积累触发干扰素和抗DNA抗体产生的已知理论，将ERVW-1的发现置于更广阔的自身免疫发病机制背景下，增加了发现的生物学合理性。