这项研究由Hanhanning、Shanhuang、Yang Lei等来自多个机构的研究人员共同完成，发表于《Nature Communications》期刊（2022年，卷13，文章编号6578）。研究聚焦于肿瘤免疫调控的表观遗传机制，揭示了组蛋白甲基转移酶MLL3和MLL4通过调控增强子功能影响肿瘤免疫逃逸的关键作用。

学术背景与研究目标 在癌症免疫治疗领域，尽管免疫检查点阻断疗法（ICB）展现出显著疗效，但多数患者仍面临原发性或获得性耐药。既往研究发现肿瘤细胞内在机制（如突变负荷、干扰素响应缺陷等）与免疫治疗响应相关，但增强子（enhancer）作为基因表达调控的关键元件，其在肿瘤免疫中的作用尚不明确。MLL3和MLL4（又称KMT2C/D）是介导组蛋白H3K4单甲基化（H3K4me1）的甲基转移酶，在增强子活性调控中发挥核心作用，且二者在多种癌症中高频突变。本研究旨在阐明MLL3/4是否通过增强子调控参与肿瘤免疫逃逸，并探索其分子机制与应用潜力。

研究流程与方法 研究分为六个主要阶段： 1. CRISPR筛选与体外验证
- 通过重新分析已发表的CRISPR/Cas9筛选数据（靶向抗原特异性CD8+ T细胞杀伤调控因子），发现MLL3/4为抑制T细胞活化的关键基因。
- 在B16-OVA黑色素瘤细胞中敲除MLL3/4（使用CRISPR/Cas9或shRNA），与OT-I CD8+ T细胞共培养。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、膜联蛋白V/PI染色证实敲除组肿瘤细胞死亡率显著升高（如MLL4敲除后LDH释放增加约50%）。
- 流式细胞术显示MLL3/4缺失促进CD8+ T细胞增殖（CFSE稀释法）及活化标志物（CD69/CD25）表达。

1. 体内肿瘤模型构建

   • 将MLL3/4敲除的B16、LLC（肺癌）和MC38（结肠癌）细胞接种至免疫健全（C57BL/6J）或免疫缺陷（Rag1−/−、裸鼠）小鼠。结果显示，仅在免疫健全小鼠中，MLL3/4缺失显著抑制肿瘤生长（体积减少70%），并延长生存期（中位生存期从25天延长至40天）。
     
   • 通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），发现MLL4−/−肿瘤中CD8+ T细胞比例增加3倍，且细胞毒性分子（IFN-γ、Granzyme B）表达上调。

2. 转录组与表观遗传分析

   • RNA-seq显示MLL4敲除后，干扰素响应通路（如ISGs、MHC I相关基因）及炎症小体相关基因（如GSDMD、CASP1）显著上调。Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 富集到”dsRNA sensing”和”pyroptosis”通路。
     
   • ChIP-seq揭示MLL4缺失导致增强子区域H3K4me1和H3K27ac信号广泛降低，尤其是超级增强子（super-enhancer）相关的基因（如DNMT3A/DNMT1、AGO2）。其中，DNMT3A启动子区甲基化水平下降50%，伴随GSDMD表达升高5倍。

3. 分子机制解析

   • dsRNA-干扰素轴：MLL4敲除降低RNA诱导沉默复合体（RISC）关键组分AGO2的表达，导致内源性逆转录病毒（ERVs）来源的dsRNA积累（通过J2抗体荧光染色验证），激活MDA5/RIG-I信号通路。阻断dsRNA传感器可部分逆转MLL4−/−肿瘤的免疫清除效应。
     
   • 焦亡通路：MLL4通过增强子维持DNMT3A/DNMT1表达，抑制GSDMD和CASP1的启动子甲基化。DNA甲基化抑制剂地西他滨可模拟MLL4缺失表型，而回补DNMT3A/DNMT1能逆转GSDMD上调。

4. 免疫治疗协同性验证

   • 在B16-OVA模型中，MLL4敲除联合抗PD-1治疗使肿瘤完全消退（对照组肿瘤体积>1000 mm³，联合组<100 mm³）。单细胞RNA测序显示联合组中CD8+ T细胞耗竭标志物（如PD-1、TIM-3）降低，效应分子表达增加。
     
   • 通过药物（双硫仑）抑制GSDMD介导的焦亡后，联合治疗效果被显著削弱（肿瘤体积回升至500 mm³），证实焦亡是免疫协同的关键机制。

5. 临床数据关联分析

   • TCGA数据库分析显示，MLL4低表达或突变的肿瘤中CD8A、GZMB表达更高，且黑色素瘤患者生存期延长（HR=0.62, p<0.01）。
     
   • 针对接受PD-1/CTLA-4治疗的患者队列，高GSDMD表达组客观缓解率提高2倍（40% vs 20%），无进展生存期延长4个月。

主要结论与价值 1. 科学价值：首次建立”增强子-表观遗传-免疫逃逸”调控轴，阐明MLL3/4通过双重机制（dsRNA-干扰素信号和GSDMD焦亡）调控肿瘤免疫原性，为表观遗传干预联合免疫治疗提供理论基础。
2. 应用潜力：MLL3/4突变或低表达可作为免疫治疗响应的预测标志物；靶向增强子或下游通路（如DNMT抑制剂）可能逆转免疫治疗耐药。
3. 创新观点：提出肿瘤细胞焦亡是天然免疫与适应性免疫的桥梁，GSDMD激活可重塑肿瘤微环境。

研究亮点 1. 方法论创新：整合CRISPR筛选、多组学分析和原位表观遗传编辑，建立从机制到转化的完整证据链。
2. 概念突破：挑战”增强子失调仅促癌”的传统认知，揭示其免疫调控新功能。
3. 临床相关性：通过10个独立患者队列验证结论的普适性，涵盖黑色素瘤、肺癌等实体瘤。

补充发现 研究还发现MLL4缺失导致PD-L1上调的”免疫抑制反馈”现象，提示联合PD-1阻断的必要性。此外，在转移模型中，MLL4敲除完全抑制黑色素瘤肺定植，提示其对转移的免疫调控作用。这些发现为后续研究提供了重要方向。