本研究由Raphael J. Eberle、Monika A. Coronado等人完成，主要研究单位包括巴西圣保罗州立大学（UNESP）生物分子创新多用户中心、德国于利希研究中心（Forschungszentrum Jülich）生物信息处理研究所（IBI-7：结构生物化学）、巴西托坎廷斯联邦大学、巴西马托格罗索南联邦大学物理研究所以及海因里希·海涅大学杜塞尔多夫物理生物学研究所等。该研究于2021年3月4日发表在开放获取期刊 PLOS ONE 上，论文标题为“In vitro study of hesperetin and hesperidin as inhibitors of zika and chikungunya virus proteases”。
虫媒病毒（arthropod-borne virus）感染已成为全球公共卫生的重大威胁。寨卡病毒（Zika virus，ZIKV，黄病毒属）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV，甲病毒属）均由埃及伊蚊（*Aedes aegypti*）和白纹伊蚊（*Aedes albopictus*）传播，且二者在美洲和巴西等地区常同时流行。临床上，ZIKV感染可导致新生儿小头畸形等严重出生缺陷，CHIKV感染则可引发慢性关节炎和认知障碍。更为严峻的是，ZIKV、CHIKV和登革病毒（DENV）的共感染（co-infection）现象日益普遍，在尼加拉瓜的一项研究中，高达27%的患者被发现同时感染两种或三种病毒。然而，目前尚无针对单一病毒感染的有效抗病毒药物，更缺乏针对共感染的治疗方案。
从药物靶点角度看，ZIKV的非结构蛋白NS3与其辅因子NS2B共同构成丝氨酸蛋白酶NS2B/NS3pro，该蛋白酶在病毒多聚蛋白的翻译后切割过程中发挥关键作用，是病毒复制所必需的。CHIKV的非结构蛋白NSP2含有一个半胱氨酸蛋白酶结构域（NSP2pro），其功能与ZIKV NS2B/NS3pro相似，同样是病毒复制周期中的核心酶。因此，这两种蛋白酶均被视为抗病毒药物开发的理想靶标。
橙皮素（hesperetin，HST，3’,5,7-三羟基-4’-甲氧基黄烷酮）和橙皮苷（hesperidin，HSD，HST的鼠李糖葡萄糖苷形式）是来自柑橘类植物的黄烷酮类黄酮化合物。已有文献报道HSD和HST具有抗氧化、抗炎、神经保护等多种药理活性，且能抑制CHIKV的胞内复制。此外，HST还被报道对蛇毒丝氨酸蛋白酶具有抑制作用。基于上述背景，本研究旨在系统评估HST和HSD对ZIKV NS2B/NS3pro和CHIKV NSP2pro的体外抑制活性，确定其半数抑制浓度（IC50）、抑制模式和结合特征，并通过分子对接和分子动力学模拟探索其可能的别构结合位点，同时评估两种化合物的细胞毒性，以判断其作为抗ZIKV和CHIKV共感染先导化合物的潜力。
本研究综合运用了蛋白质表达纯化、酶学抑制实验、荧光光谱分析、细胞毒性实验、抗病毒实验以及计算模拟等多种技术手段，构建了从分子水平到细胞水平的完整研究链条。
第一，病毒蛋白酶的表达与纯化。 ZIKV NS2B/NS3pro（GenBank登录号KU729217.2，巴西分离株BeH823339）按照此前文献描述的方法克隆、表达和纯化。CHIKV NSP2pro（残基466–798，包含N端半胱氨酸蛋白酶结构域和C端SAM依赖性甲基转移酶结构域，GenBank登录号AAN05101.1，S27非洲原型株）由德国Biocat GmbH合成，克隆至卡那霉素抗性载体pET-24a(+)中，带有N端六聚组氨酸标签和TEV蛋白酶酶切位点。该质粒转化至E. coli (DE3) T1菌株，经IPTG诱导表达后，依次通过Ni-NTA亲和层析和Superdex 75分子筛层析纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE确认纯度。
第二，蛋白酶抑制实验及IC50测定。 ZIKV NS2B/NS3pro的酶活性通过荧光底物Pyr-Arg-Thr-Lys-Arg-AMC检测，实验在20 mM Tris-HCl（pH 8.5）、10%甘油、0.01% Triton X-100的缓冲液中进行，蛋白浓度为3 nM，底物终浓度为20 μM，HST浓度范围为0–140 μM。反应在37°C下进行，激发波长380 nm，发射波长460 nm，连续监测10分钟。CHIKV NSP2pro的活性通过FRET底物Dabcyl-Arg-Ala-Gly-Gly-#Tyr-Ile-Phe-Ser-Edans检测，该底物源自CHIKV非结构蛋白NSP3-NSP4之间的切割位点，包含八个氨基酸残基。反应在20 mM Bis-Tris-Propane（pH 7.5）缓冲液中进行，蛋白浓度为1 μM，底物终浓度为3 μM，抑制剂浓度范围分别为HST 0–30 μM和HSD 0–45 μM，25°C下激发波长340 nm，发射波长490 nm，连续监测60分钟。所有实验均重复三次，通过非线性回归绘制剂量-效应曲线计算IC50值。
第三，抑制模式的确定。 采用Lineweaver-Burk双倒数作图法确定抑制类型。ZIKV NS2B/NS3pro（3 nM）与不同浓度的HST（0–5 μM）预孵育60分钟后，加入不同浓度梯度的底物（0–50 μM）启动反应；CHIKV NSP2pro（1 μM）分别与HST（0–5 μM）和HSD（0–20 μM）预孵育后，加入0–2.0 μM的底物梯度。通过比较不同抑制剂浓度下的Vmax和Km变化，判断抑制模式。
第四，配体效率计算。 利用公式LE = (1.4 × pIC50) / N计算配体效率，其中pIC50通过在线工具从IC50换算获得，N为非氢原子数。HST的非氢原子数为22，HSD为43。
第五，荧光光谱分析。 利用色氨酸（Trp）内源荧光在295 nm激发波长下监测蛋白-配体相互作用。蛋白浓度为5 μM，通过逐步滴加配体（ZIKV NS2B/NS3pro-HST和-HSD：0–150 μM；CHIKV NSP2pro-HST和-HSD：0–206 μM），在300–500 nm范围收集发射光谱。通过荧光淬灭数据拟合饱和结合曲线和修正的Hill方程，计算解离常数（Kd）。此外，在20–85°C范围内进行热变性实验，以5°C为步长，测定蛋白在有无配体存在时的熔解温度（Tm）变化。
第六，细胞活力MTT实验。 Vero细胞以104/孔接种于96孔板，用2.3–300 μM浓度梯度的HST或HSD处理48小时，随后加入1 mg/mL的MTT溶液孵育1小时，DMSO溶解甲臜结晶，在560 nm处测定吸光度，计算细胞活力百分比。
第七，抗病毒噬斑减少实验。 在24孔板中接种80,000 Vero E6细胞/孔，使用约50 PFU的固定病毒接种量（ZIKVBR58和来自巴西病毒血症患者的CHIKV），在含或不含化合物的1%羧甲基纤维素覆盖层中培养三天。随后固定并结晶紫染色，计数噬斑，比较处理组与对照组的差异。
第八，分子对接与分子动力学模拟。 使用AutoDock Vina 1.1.12进行蛋白-配体对接计算。ZIKV NS2B/NS3pro的晶体结构取自PDB数据库（PDB编号5LC0），CHIKV NSP2pro取自PDB（编号3TRK）。使用AMBER18软件包进行分子动力学模拟，蛋白采用ff14SB力场，配体采用GAFF力场和RESP电荷。体系置于TIP3P水盒子中，经过两步能量最小化、NVT系综加热至298 K、NPT系综平衡500 ps后，进行200 ns的成品模拟，时间步长为2 fs。通过cpptraj程序计算RMSD、RMSF、回旋半径（RoG）、表面积等参数，并采用MM/GBSA方法计算蛋白-配体相互作用能。
初步筛选与IC50测定。 在20 μM浓度下，HST对ZIKV NS2B/NS3pro的抑制率约为40%，对CHIKV NSP2pro的抑制率约为90%；HSD对CHIKV NSP2pro的抑制率超过60%，但对ZIKV NS2B/NS3pro仅表现出不显著的抑制作用。完整的剂量-效应实验确定：HST对ZIKV NS2B/NS3pro的IC50为12.6 ± 1.3 μM，对CHIKV NSP2pro的IC50为2.5 ± 0.4 μM；HSD对CHIKV NSP2pro的IC50为7.1 ± 1.1 μM。这一结果表明HST对CHIKV蛋白酶具有极强的抑制活性，其IC50值与文献报道的novobiocin（2 μM）和telmisartan（5 μM）处于同一水平，但明显优于Singh等人报道的两种肽类抑制剂（IC50均为40 μM左右）。对于ZIKV蛋白酶，HST的活性与isorhamnetin（15.5 μM）相当，虽然略低于myricetin（1.3 μM）、quercetin（2.4 μM）和luteolin（2.7 μM），但仍属于低微摩尔级别的有效抑制剂。
抑制模式分析。 Lineweaver-Burk作图显示，HST对ZIKV NS2B/NS3pro的抑制表现为Vmax降低而Km不变，符合非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）的典型特征。同样，HST和HSD对CHIKV NSP2pro的抑制也呈非竞争性模式。这意味着抑制剂结合的位点不同于底物结合位点，提示存在别构抑制机制。
配体效率。 HST对ZIKV和CHIKV蛋白酶的配体效率分别为0.31和0.36，均大于0.3的常用阈值，表明HST是一个高效的配体分子，具备作为先导化合物进行后续优化的良好潜质。相比之下，HSD的配体效率仅为0.17，低于阈值，这可能与其较大的分子体积（43个非氢原子）有关。
荧光光谱与热稳定性。 通过Trp荧光淬灭滴定实验，测得HST与ZIKV NS2B/NS3pro的解离常数为17.8 ± 2.9 μM，与CHIKV NSP2pro的Kd为31.6 ± 2.5 μM；HSD与CHIKV NSP2pro的Kd为40.7 ± 2.0 μM。热变性实验显示，ZIKV NS2B/NS3pro的Tm为43°C，在其与HST结合后，Tm升高至49°C（ΔTm = +6°C）；CHIKV NSP2pro的Tm为47°C，与HST结合后升高至55°C（ΔTm = +8°C），与HSD结合后升高至52°C（ΔTm = +5°C）。Tm的显著升高表明配体结合增强了蛋白的热力学稳定性，从实验角度证实了HST和HSD与两种蛋白酶之间确实存在特异性相互作用，且该相互作用引起了蛋白构象的稳定化。
分子动力学模拟与结合位点分析。 200 ns的分子动力学模拟结果显示，HST与ZIKV NS2B/NS3pro的相互作用涉及多个氨基酸残基：NS2B结构域的Val29、Leu31和Phe37，以及NS3蛋白酶结构域的Thr119、Asp121、Ile124和Asn152。其中，Asn152的侧链NH2基团作为氢键供体，与HST的O1原子形成单一的氢键（距离2.9 Å），其余残基通过疏水相互作用稳定结合。值得注意的是，催化三联体（His51、Asp75、Ser135）不与配体发生直接接触，这与非竞争性抑制的实验结果完全吻合。两次独立模拟的运行结果高度一致（RMSD为1.475 Å），验证了HST结合位置的可靠性。
对于CHIKV NSP2pro，HST与11个氨基酸残基相互作用，全部位于半胱氨酸蛋白酶结构域：Pro47、Glu48、Leu51、Leu63、Val75、Tyr76、Tyr77、Trp82、Gly88、Lys89和Phe91。其中Lys89的主链NH基团作为受体与HST的O5（羟基）形成一条氢键（距离3.4 Å），其余残基参与疏水接触。HSD则与8个蛋白酶结构域残基（Pro47、Glu48、Val75、Tyr76、Tyr77、Trp82、Lys89、Phe91）和3个甲基转移酶结构域残基（Leu203、Met236、Met240）相互作用。HSD形成了三条氢键：Glu48主链NH与O3（2.6 Å）、Val75主链O与O8（2.8 Å）、Tyr77主链O与O10（3.5 Å），这些氢键均涉及HSD糖基部分的羟基。更多的氢键数量解释了CHIKV NSP2pro-HSD复合物更高的结合能（-37.1 ± 3.7 kcal/mol），而CHIKV NSP2pro-HST和ZIKV NS2B/NS3pro-HST的结合能分别为-23.5 ± 2.3 kcal/mol和-25.5 ± 4.1 kcal/mol。
底物结合口袋的构象变化。 对底物结合亚位点S1、S1’、S2、S3、S4和氧阴离子洞的分析表明，配体结合后两种蛋白酶的底物结合口袋均发生了构象变化。在ZIKV NS2B/NS3pro中，Asn152与HST的氢键可能改变了底物结合位点的形状；在CHIKV NSP2pro中，Tyr77（位于S3亚位点）和Trp82（位于S2和S4亚位点）与HSD的相互作用改变了这些亚位点的可及性。这些构象变化可能阻止了底物的有效结合，从而解释了非竞争性抑制的分子机制。
细胞毒性与抗病毒活性。 MTT实验表明，在高达300 μM的浓度下，HST和HSD对Vero细胞均未显示明显的细胞毒性，50%细胞毒性浓度（CC50）未能达到。这一结果与文献中柑橘类黄酮具有极高安全性的报道一致。然而，噬斑减少实验显示，无论是HST还是HSD，在测试浓度下均未表现出对ZIKV或CHIKV的直接抗病毒活性。这可能是因为噬斑减少实验使用的是完整的病毒复制周期，涉及病毒进入、脱壳、复制、组装和释放等多个步骤，而这两种化合物可能无法有效穿透细胞膜或达到足够的细胞内浓度来抑制病毒蛋白酶。
本研究首次系统证明HST能够同时抑制ZIKV NS2B/NS3丝氨酸蛋白酶和CHIKV NSP2半胱氨酸蛋白酶，IC50值均在低微摩尔范围，且均为非竞争性抑制剂。HSD对CHIKV NSP2pro也表现出较强的抑制活性，但对ZIKV蛋白酶仅有微弱作用。配体效率计算表明HST（LE > 0.3）具备作为先导化合物的良好潜质。荧光光谱实验证实两种化合物与靶蛋白酶之间存在真实且可量化的相互作用，热变性实验中Tm的显著升高（最高+8°C）进一步支持了结合导致的蛋白稳定化。分子动力学模拟揭示了可能的别构结合位点，这些位点与文献报道的别构口袋基本吻合，且配体结合后底物结合口袋的构象变化为非竞争性抑制机制提供了合理的结构解释。虽然MTT实验显示两种化合物细胞毒性极低，但噬斑减少实验未检测到直接的抗病毒效果。
本研究的学术价值主要体现在以下方面：第一，首次报道了同一天然化合物对黄病毒和甲病毒两大不同病毒科的关键蛋白酶同时具有抑制作用，这为开发针对ZIKV和CHIKV共感染的广谱抗病毒药物提供了重要的先导分子。第二，通过系统的酶动力学、荧光光谱和分子动力学模拟相结合的方法，不仅确定了抑制活性和抑制模式，还深入到分子水平阐明了作用机制。第三，确认了两种蛋白酶中别构位点的存在及其药物开发潜力，为后续基于结构的药物设计奠定了基础。第四，所采用的多种生物物理学和计算生物学方法相互印证，形成了完整而严谨的证据链条。
从应用角度看，HST作为一种来源丰富、安全性极高的天然产物，其先导化合物地位意味着可以通过后续的化学修饰来优化其药物性质，例如提高细胞膜通透性、增强对靶蛋白的亲和力、改善代谢稳定性等。虽然噬斑减少实验未显示抗病毒活性，但蛋白酶抑制实验结果仍然具有重要意义，因为先导化合物的发现是药物开发链条中的关键第一步，而本研究成功完成了这一步骤的验证。
论文还讨论了HSD在人体肠道中可被微生物群部分去糖基化转化为HST的代谢特性。这意味着口服HSD后，体内可能同时存在HST和HSD的混合物，而根据本研究的结果，这种混合物有望同时强效抑制ZIKV和CHIKV两种蛋白酶。此外，HST和HSD对人类丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）的IC50值在104–127 μM范围，比本研究中对病毒蛋白酶的抑制浓度高10–50倍，提示其在有效抑制病毒蛋白酶的浓度下不太可能影响人体消化酶的活性，这进一步支持了其安全性。