本研究由兰州理工大学生命科学与工程学院的张百刚、裴悦、张玉娇，以及温州市农科院温州市特色食品资源工程技术研究中心/全省食用农产品资源挖掘与高值利用重点实验室的李群和、周环、金微微共同完成。该研究成果以《不同菌种发酵对桑葚多糖结构特征及生物活性的影响》为题，于2025年12月26日在《食品工业科技》期刊上进行了网络首发。
该研究属于食品科学、食品生物技术及天然产物化学交叉领域。研究的学术背景在于，桑葚作为一种药食同源资源，其富含的多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、免疫调节等多种生物活性，是功能食品和药品开发的热点。然而，传统方法提取的多糖常因分子量分布宽、活性基团掩蔽等问题，导致其生物活性未能充分发挥。为了突破这一局限，研究者们探索了多糖的分子修饰策略。相较于可能破坏糖环完整性的物理修饰和可能引入有毒残留的化学修饰，利用微生物进行的发酵修饰因其在温和条件下通过多酶协同作用重塑多糖结构，且过程绿色环保，而展现出独特优势。虽然已有研究证实发酵能改变多糖结构并提升其活性，但针对桑葚多糖的发酵改性研究尚不多见，且不同菌种间的对比分析较为缺乏。因此，本研究旨在系统探究植物乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌这三种食品级安全菌株的发酵作用，如何特异性改变桑葚多糖的结构，并进而影响其抗氧化、降血糖和免疫调节活性，以期为桑葚多糖的高效改性与高值化应用提供新的策略和科学依据。
本研究的工作流程详细且系统，主要包含以下几个关键步骤： 首先，是原料处理与多糖的提取纯化。研究选用浙江金华产的无籽大十桑葚干果为原料。将其烘干、粉碎后，用95%乙醇进行脱脂处理，直至上清液接近无色，以去除脂溶性杂质。随后，采用超声辅助提取法获取桑葚粗多糖，具体条件为：液料比20 mL/g，提取温度55℃，超声功率180 W，时间30 min，频率30 kHz，提取两次。合并滤液后，通过4℃醇沉过夜获得粗多糖沉淀。接着，对粗多糖进行初步纯化。采用Sevag法（正丁醇：三氯甲烷=1:4）反复去除蛋白质，直至两相间无乳白色絮状物。之后，使用D-354FD大孔树脂进行脱色处理，并用截留分子量为7000 Da的透析袋在纯水中透析48小时，最后冷冻干燥，得到未发酵的桑葚多糖样品（MFP）。
其次，是发酵多糖的制备。研究选用了三种标准菌株：植物乳杆菌（ATCC 14917）、酿酒酵母（ATCC 9763）和枯草芽孢杆菌（ATCC 9327）。分别使用MRS、YPD和LB液体培养基对菌种进行活化复苏。将桑葚粉末按相同液料比（20 mL/g）加水制成匀浆，灭菌后，分别按4%的接种量接入三种活化好的菌液。植物乳杆菌在37℃下静置培养24小时，酿酒酵母和枯草芽孢杆菌在30℃下静置培养24小时。发酵结束后，对发酵物料进行二次灭菌，再采用与未发酵样品完全相同的超声辅助提取和纯化流程，最终分别制得植物乳杆菌发酵桑葚多糖（MFP-Z）、酿酒酵母发酵桑葚多糖（MFP-N）和枯草芽孢杆菌发酵桑葚多糖（MFP-K）。
第三，是四种多糖（MFP， MFP-Z， MFP-N， MFP-K）的结构表征与化学成分分析。研究采用了一系列标准方法进行测定：使用硫酸-苯酚法测定总糖含量；考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；间羟基联苯法测定糖醛酸含量；并计算了多糖得率。通过紫外光谱（200-600 nm扫描）检测核酸和蛋白质残留。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR，波长范围4000-400 cm⁻¹）分析多糖的主要官能团和糖苷键构型。采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC，色谱柱为两根聚合物基质水溶性SEC色谱柱串联，流动相为0.05M NaCl，流速0.5 mL/min，柱温40℃）测定多糖的分子量（Mw）、数均分子量（Mn）及多分散性指数（Mw/Mn）。通过高效液相色谱法（HPLC）结合1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化技术，分析多糖的单糖组成及摩尔百分比，使用了包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等在内的11种单糖标准品进行比对。
第四，是体外生物活性评价。研究系统评估了四种多糖的抗氧化、降血糖和免疫调节活性。抗氧化活性通过DPPH自由基清除实验和ABTS自由基清除实验进行测定，以维生素C（VC）作为阳性对照，在517 nm和723 nm波长下分别测量吸光度，计算清除率和半数有效浓度（EC₅₀）。降血糖活性通过测定对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率来评价，以阿卡波糖为阳性对照，分别在520 nm和400 nm波长下测量吸光度，计算抑制率和半数抑制浓度（IC₅₀）。免疫调节活性则通过小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）模型进行。首先采用CCK-8法检测不同浓度多糖（50-800 μg/mL）对细胞增殖的影响，以确定安全且有效的浓度范围（最终选用50， 200， 400 μg/mL）。随后，通过中性红吞噬实验测定多糖对巨噬细胞吞噬活性的影响。最后，使用Griess试剂盒测定细胞上清中一氧化氮（NO）的释放量，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平，以脂多糖（LPS）作为阳性对照。
第五，是数据处理。所有实验均重复3次，数据以平均值±标准偏差表示。使用Excel 2016和SPSS 22.0软件进行统计分析，采用Origin Pro 2021软件作图。使用单因素方差分析进行组间差异比较，以p < 0.05表示具有统计学显著性差异。
本研究取得了系统且明确的结果，各部分结果逻辑连贯，共同支撑了最终结论。 在化学成分与得率方面，发酵显著提升了桑葚多糖的提取效率与纯度。多糖得率从未发酵组（MFP）的3.65%分别提高到MFP-N（4.79%）、MFP-K（4.60%）和MFP-Z（4.09%）。总糖含量也从MFP的33.98%显著提升至MFP-N（65.01%）、MFP-K（61.67%）和MFP-Z（55.23%）。糖醛酸含量也因发酵而增加，其中MFP-K最高（47.88%），表明发酵过程可能降解了细胞壁中的果胶类物质，释放出更多酸性糖。所有样品的蛋白质含量均低于2%，证明纯化效果良好。这些结果为后续观察到的活性提升提供了物质基础——更高的多糖得率和纯度意味着活性成分的富集。
在结构表征方面，紫外光谱显示所有样品在260 nm处无吸收峰，表明不含核酸；在280 nm处有微弱吸收，表明含有微量蛋白质，这与低蛋白含量的测定结果一致。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示，四种多糖在3410 cm⁻¹（O-H伸缩振动）、2930 cm⁻¹（C-H伸缩振动）、1733 cm⁻¹附近（糖醛酸C=O）、1613 cm⁻¹和1421 cm⁻¹（羰基和C-O振动）、1072 cm⁻¹（吡喃糖环C-O-C/C-O-H）、894 cm⁻¹（β-型糖苷键）及816 cm⁻¹（可能为α-构型环振动）等处均有特征吸收峰。这表明发酵并未破坏桑葚多糖的主要官能团和主体结构骨架，所有样品均为含有β-糖苷键的酸性多糖。这一结果至关重要，它排除了发酵导致多糖基本化学结构被彻底改变的可能性，暗示后续的活性差异主要源于精细结构的修饰。
分子量分布分析揭示了不同菌种发酵的特异性影响。未发酵多糖MFP由三个组分构成，重均分子量（Mw）为239.5 kDa，多分散性指数（PDI）为1.47。发酵后，分子量变化呈现菌株特异性：植物乳杆菌发酵（MFP-Z）使多糖Mw升高至281.3 kDa，且PDI增大至6.24，提示可能存在高分子量聚集体；而酿酒酵母发酵（MFP-N）和枯草芽孢杆菌发酵（MFP-K）则使多糖Mw分别降低至109.96 kDa和64.28 kDa。其中MFP-N为单一组分，但PDI高达10.65，分布很宽；MFP-K由两个组分构成，PDI为1.69，均一性相对最好。这一结果直接关联到后续的生物活性，特别是抗氧化活性，因为低分子量多糖通常具有更好的溶解性和更多的暴露活性位点。
单糖组成分析进一步揭示了结构差异。MFP、MFP-N和MFP-Z均由相同的9种单糖组成：甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖（盐酸氨基葡萄糖）、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，但各单糖的摩尔比例不同。值得注意的是，MFP-K除了上述9种单糖外，还检测到了微量的氨基半乳糖盐酸盐。更重要的是，与未发酵的MFP（半乳糖醛酸占比9.93%）相比，三种发酵多糖中酸性糖半乳糖醛酸的相对含量均显著增加（MFP-N: 16.85%， MFP-K: 16.09%， MFP-Z: 18.80%）。同时，MFP-Z中葡萄糖的比例显著下降。这些变化被认为是微生物分泌的果胶酶等酶类作用于桑葚细胞壁的结果，而非菌体自身多糖的引入（因为相关特征单糖未显著增加）。单糖组成和比例的变化是决定多糖生物活性的关键因素之一。
在生物活性结果方面，研究显示了发酵修饰带来的显著提升。抗氧化活性方面，DPPH和ABTS自由基清除实验均表明，三种发酵多糖的活性均显著高于未发酵MFP，且呈浓度依赖性。综合EC₅₀值，总体抗氧化能力排序为：MFP-N > MFP-K > MFP-Z > MFP。这与MFP-N和MFP-K分子量降低、活性位点更易暴露的分析相一致。降血糖活性方面，四种多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均表现出剂量依赖性的抑制能力。在8 mg/mL浓度下，对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为MFP-N（84.94%），对α-淀粉酶的抑制率最高也为MFP-N（61.95%）。综合IC₅₀值，降血糖能力排序为：MFP-N > MFP-Z > MFP-K > MFP。MFP-N表现最优，可能与其较高的总糖含量和特定的结构修饰有关。
免疫调节活性结果最为突出。细胞毒性实验表明，在50-800 μg/mL浓度范围内，四种多糖对RAW264.7细胞均无毒性，且在400 μg/mL时促增殖作用达到极显著水平。在吞噬活性实验中，所有多糖均能增强巨噬细胞的吞噬能力，其中MFP-K和MFP-N在200 μg/mL时促进作用即达到极显著水平，而MFP需要到400 μg/mL。在免疫因子分泌方面，四种多糖均能浓度依赖性地促进RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-6。当浓度为400 μg/mL时，MFP-K促进NO分泌的效果最佳（达到LPS阳性对照组的70%以上），MFP-N在促进TNF-α和IL-6分泌方面也表现突出。值得注意的是，MFP-Z在免疫调节方面的增强作用相对较弱。这些结果清晰地表明，发酵，特别是枯草芽孢杆菌和酿酒酵母发酵，能显著增强桑葚多糖的免疫激活潜力。
本研究的结论是，利用植物乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌对桑葚进行发酵，是一种有效的多糖改性策略。发酵能在不破坏多糖主要官能团的前提下，特异性（菌株依赖性）地改变桑葚多糖的分子量、单糖组成等结构特征，从而显著改善其生物活性。具体而言，酿酒酵母发酵（MFP-N）在提升多糖得率、总糖含量以及增强抗氧化和降血糖活性方面表现最为综合和突出；而枯草芽孢杆菌发酵（MFP-K）则在增强免疫调节活性（尤其是激活巨噬细胞）方面展现出显著优势。植物乳杆菌发酵（MFP-Z）对分子量有独特影响，但其生物活性提升幅度相对另两种菌种较小。
这项研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学层面，它系统地揭示了不同微生物（乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌）通过其独特的酶系和代谢途径，对同一种植物多糖进行差异化结构修饰的规律，深化了对“发酵-结构-活性”构效关系的理解，为微生物发酵改性天然多糖提供了具体的案例和机理线索。在应用层面，该研究为桑葚这一传统药食同源资源的高值化开发利用开辟了新途径。通过定向选择发酵菌种，可以有针对性地增强桑葚多糖的特定生物活性，从而为其在功能性食品（如抗氧化、辅助降血糖食品）、保健品乃至药品（如免疫调节剂）领域的精准开发提供理论依据和技术支持。研究证实了发酵修饰作为一种绿色、安全的物理-生物联合改性技术的巨大潜力。
本研究的亮点在于：第一，研究内容的系统性与对比性。首次同时比较了三种不同类型食品级微生物（细菌、酵母）发酵对桑葚多糖结构及多种生物活性（抗氧化、降糖、免疫）的综合性影响，数据全面，对比鲜明。第二，明确的菌株特异性效应。研究不仅证实了发酵可以改善活性，更重要的是发现了不同菌种产生不同改性效果的规律，例如酿酒酵母在降糖和抗氧化方面的优势，以及枯草芽孢杆菌在免疫激活方面的特长，这为未来的应用提供了明确的菌种选择指导。第三，结构分析与活性评价的紧密结合。研究通过HPGPC、HPLC、FT-IR等手段详细表征了发酵前后多糖的分子量、单糖组成和官能团变化，并将这些结构参数与体外活性结果进行了关联分析，使“结构决定功能”的推论有了扎实的数据支撑。第四，研究路径的规范性。从菌种活化、发酵、提取纯化，到全面的结构表征和多重生物活性评价，实验设计严谨，方法标准，数据可靠，体现了良好的学术规范性。
此外，研究中关于“菌体自身多糖贡献较小”的讨论也具有一定价值。作者通过分析单糖组成数据，发现发酵并未导致相应菌种特征性胞外多糖单糖（如酿酒酵母的甘露糖、植物乳杆菌的葡萄糖）含量异常升高，从而推断观察到的结构变化主要源于微生物对桑葚原料多糖的修饰，而非自身多糖的混入。这一分析增强了结论的说服力，但也如作者所言，此问题仍需更深入的探讨。