本文发表于 *Analytical Chemistry*，2025年，第97卷，第4049−4056页。该研究由青岛大学化学化工学院、临沂大学医学院等机构的研究人员共同完成，主要作者包括杜庆雨、张浩宇、毕莹娜、王慧杰、周学敏、石鹏飞、吕姝臻和毕赛。该研究报道了一种基于氮缺陷硼掺杂g-C₃N₄/CdS（N-deficient B-doped g-C₃N₄/CdS，NB-g-C₃N₄/CdS）异质结的近红外光驱动光电化学-荧光（PEC-FL）双模式生物传感器，并结合CRISPR-Cas12a系统，实现了对微小RNA-21（miRNA-21）的超灵敏检测。
研究背景方面，近红外光（NIR）驱动的光电化学（PEC）生物分析是一种具有优异稳定性、良好重现性以及高灵敏度和选择性的分析技术。然而，现有近红外光驱动的PEC过程通常面临光电流较弱的问题，限制了其在实际检测中的应用。g-C₃N₄因其独特的电子结构、可调的带隙以及高稳定性，被广泛用于PEC生物传感。但其固有的载流子分离效率低和PEC响应一般等缺陷，制约了其进一步发展。为了提升g-C₃N₄的光吸收和光生电子-空穴对分离能力，本研究通过引入氮缺陷、硼掺杂以及与CdS形成异质结等方式，对g-C₃N₄的电子结构和能带结构进行调控，从而获得高性能的NB-g-C₃N₄/CdS复合材料。同时，上转换纳米粒子（UCNPs）能够吸收近红外光并发射紫外-可见光，但其较低的发光效率限制了PEC响应。本研究制备了具有修复缺陷的核壳结构NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺@NaYF₄上转换纳米粒子，以提高近红外激发下的发光效率。此外，CRISPR-Cas12a系统因其对单链DNA（ssDNA）的反式切割活性，在分子诊断和信号放大中显示出极大潜力。本研究将滚环扩增（RCA）与CRISPR-Cas12a系统结合，用于切割UCNPs上的信号探针，实现对miRNA-21的高灵敏检测。该双模式生物传感器不仅提高了检测灵敏度，还通过PEC和荧光两种信号的相互验证，提高了检测结果的准确性。
研究工作流程主要包括材料制备、信号放大体系构建以及双模式检测三个部分。在材料制备方面，研究人员首先通过将NaBH₄和g-C₃N₄在惰性气氛中煅烧，得到氮缺陷硼掺杂的NB-g-C₃N₄。然后将NB-g-C₃N₄与CdS纳米粒子混合，经超声分散、持续搅拌、离心洗涤、干燥和300 °C煅烧，获得NB-g-C₃N₄/CdS复合纳米粒子。同时，制备了核壳结构NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺@NaYF₄上转换纳米粒子，并对其进行氨基修饰，再与羧基化的ssDNA信号探针连接，形成UCNPs-DNA信号探针。在信号放大体系构建中，当目标miRNA-21存在时，会触发RCA反应，产生长的DNA产物，进而激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性。该活性能够切割UCNPs-DNA信号探针上的ssDNA，使部分信号探针保持完整（未被切割），部分被切割。在PEC模式下，未切割的信号探针通过π−π堆积作用与NB-g-C₃N₄/CdS结合，在980 nm激光照射下产生光电流；在荧光模式下，被切割的信号探针无法与NB-g-C₃N₄/CdS结合，从而表现出荧光信号。实验过程中，研究人员利用透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、电子顺磁共振（EPR）、X射线衍射（XRD）以及能量色散X射线光谱（EDS）等方法对材料进行了表征。同时，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、zeta电位和紫外-可见吸收光谱等手段验证了CRISPR-Cas12a系统的切割活性以及UCNPs-DNA探针的成功构建。在检测过程中，使用三电极体系（铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，FTO为工作电极）在980 nm激光照射下进行i-t模式的光电流检测。荧光检测则使用808 nm激发波长测量上转换发光强度。
研究结果显示，TEM图像表明NB-g-C₃N₄呈层状结构，CdS为球形结构，两者形成了异质结。FTIR中2180 cm⁻¹处的新峰证实了氮缺陷的存在，XPS中191.2 eV处B 1s的特征峰证明了硼的成功掺杂，EPR信号的增强进一步确认了氮空位的存在。XRD图谱显示NB-g-C₃N₄/CdS同时具有g-C₃N₄和CdS的特征衍射峰，表明异质结成功构建。PEC性能测试表明，NB-g-C₃N₄/CdS/上转换纳米粒子在980 nm激光照射下的光电流明显高于g-C₃N₄/上转换纳米粒子、NB-g-C₃N₄/上转换纳米粒子以及g-C₃N₄/CdS/上转换纳米粒子，说明氮缺陷、硼掺杂和异质结构建共同优化了g-C₃N₄的能带结构，抑制了电子-空穴对复合，提高了光电转换效率。电化学阻抗谱（EIS）结果也显示NB-g-C₃N₄/CdS/上转换纳米粒子的界面电荷转移电阻最小，进一步支持了其优异的PEC性能。PAGE实验证实了RCA产物能够激活CRISPR-Cas12a系统的顺式和反式切割活性，使RCA产物和信号探针被切割。zeta电位和紫外-可见吸收光谱结果表明ssDNA成功修饰在核壳上转换纳米粒子表面。Feasibility实验中，在miRNA-21存在时，光电流降低而荧光信号增强；在miRNA-21不存在时，光电流较高而荧光信号较低，证明了双模式检测的可行性。在双模式检测的传感性能方面，PEC模式的光电流随miRNA-21浓度增加而降低，在0.02−50 pM范围内具有良好的线性关系（R²=0.995），检测限为1.1 fM；荧光模式的荧光强度随miRNA-21浓度增加而增强，在0.1−50 pM范围内线性良好（R²=0.994），检测限为7.0 fM。特异性实验显示，即使干扰物浓度为miRNA-21的10倍，单碱基错配miRNA-21、三碱基错配miRNA-21、miRNA-122和miRNA-155存在时，PEC和荧光信号几乎与空白样品相同，表明该生物传感器具有良好的选择性。真实样品分析中，在人血清中添加不同浓度miRNA-21进行回收率测试，回收率在96.0%−104.8%之间，相对标准偏差（RSD）为0.54%−4.7%。此外，从HeLa细胞和MCF-7细胞中提取的RNA经20倍稀释后检测，MCF-7细胞中miRNA-21含量高于HeLa细胞，且PEC和荧光模式检测结果与定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果一致，验证了该生物传感器在复杂生物体系中的实用性。
本研究的主要结论是：成功构建了一种基于CRISPR-Cas12a辅助的近红外光驱动PEC-FL双模式生物传感器，用于miRNA-21的超灵敏检测。通过氮缺陷、硼掺杂和异质结构建，显著提高了g-C₃N₄的光电性能；结合高效发光的核壳上转换纳米粒子和RCA-CRISPR-Cas12a信号放大策略，实现了对miRNA-21的高灵敏和特异性检测。PEC和荧光双信号输出为检测结果提供了相互验证，提高了分析的准确性和全面性。该生物传感器在恶性肿瘤的早期诊断和预后治疗中具有广阔的应用前景。
本研究的亮点包括：第一，首次将氮缺陷、硼掺杂和CdS异质结同时引入g-C₃N₄，协同优化了其能带结构和光电性能，显著增强了近红外光驱动下的PEC响应。第二，构建了PEC-荧光双模式检测平台，利用同一批反应体系同时获得两种独立的检测信号，实现了结果互验，提高了检测可靠性。第三，将RCA与CRISPR-Cas12a系统结合，利用靶标诱导的RCA反应激活Cas12a的反式切割活性，实现了对信号探针的高效切割和信号放大，使检测限达到飞摩尔级别。第四，该传感器在真实样品中表现出良好的准确性和实用性，显示了在临床诊断中的应用潜力。