本研究由Atsushi Imakiire、Hideto Morimoto、Hidehiko Suzuki、Tomomi Masuda、Eiji Yoden、Asuka Inoue、Hiroki Morioka、Takashi Konaka、Ayaka Mori、Ryoji Shirasaka、Ryo Kato、Tohru Hirato、Hiroyuki Sonoda及Kohtaro Minami等人完成，所有作者均来自JCR Pharmaceuticals研究部门。通讯作者为Kohtaro Minami。该研究发表于*Molecular Pharmaceutics*期刊，2023年第20卷，第5901至5909页，并于2023年10月20日在线发表。该论文属于期刊的虚拟专刊“工业药物递送与制剂科学前沿研究”的一部分。
黏多糖贮积症（mucopolysaccharidoses，MPSs）是一组溶酶体贮积病，其特征是糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）在全身异常积累。其中，II型黏多糖贮积症（MPS II），又称亨特综合征（Hunter syndrome），是由于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulfatase，IDS）缺乏，导致其底物硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）和硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）在溶酶体内沉积，进而损害多种组织的细胞功能。MPS II患者表现出多种临床症状，包括面容粗陋、肝脾肿大、心脏瓣膜病、呼吸衰竭、肌肉骨骼异常和视力丧失等。严重型MPS II患者还会出现进行性中枢神经系统（central nervous system，CNS）症状。
尽管酶替代疗法（enzyme-replacement therapy，ERT）可用于治疗MPS II患者，但传统的静脉注射重组IDS对中枢神经系统症状和视网膜病变均无效。其原因在于血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）和血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）限制了大分子药物从血液循环进入脑和视网膜组织。视网膜由两种不同的BRB保护：外屏障由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞构成，内屏障的结构与BBB相似，由具有紧密连接的视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞和Müller胶质细胞构成。RPE细胞和视网膜毛细血管内皮细胞均表达转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR），负责将转铁蛋白结合的铁转运入视网膜。
Pabinafusp alfa是一种由抗人转铁蛋白受体抗体与IDS融合而成的融合蛋白，此前已被证实能够穿越BBB进入食蟹猴和MPS II模型小鼠的脑神经元，并在日本获批用于治疗所有类型的MPS II患者，包括神经病变型。基于BRB与BBB在结构和铁转运机制上的相似性，研究者提出假设：pabinafusp alfa也可能穿越BRB到达视网膜并改善视觉功能。本研究旨在验证这一假设，并评估pabinafusp alfa静脉给药后对MPS II模型小鼠视网膜的药物递送和治疗效果。
本研究共包含五个主要实验环节：视网膜功能障碍的评估、视网膜药物递送检测、长期疗效研究（包括HS测定、视网膜电图检测和组织学分析）以及视网膜细胞分离计数。
研究使用两种MPS II模型小鼠：IDS基因敲除（ids-KO）小鼠（C57BL/6背景）以及表达人TfR的IDS缺陷（hTfR-KI/ids-KO）小鼠。后者通过ids-KO小鼠与hTfR-KI小鼠杂交获得。C57BL/6野生型小鼠作为正常对照。所有动物实验方案经JCR Pharmaceuticals动物管理与使用委员会批准。测试药物为pabinafusp alfa（JR-141）和重组非融合人IDS，后者在中国仓鼠卵巢细胞中生产。
研究者使用视网膜电图（electroretinography，ERG）评估不同年龄的MPS II（ids-KO）小鼠的视网膜功能。ERG在10 cd·s/cm²光刺激强度下记录，该强度同时包含视锥细胞和视杆细胞反应。结果显示MPS II小鼠在11周龄时即表现出a波和b波振幅下降的趋势，且随年龄增长趋势变得明显并具有统计学意义。此外，老年MPS II小鼠的b/a波比值较同龄野生型小鼠升高，提示MPS II疾病对光感受器产生的a波的影响大于对无长突细胞/双极细胞产生的b波的影响。
为检测pabinafusp alfa能否将IDS酶递送至视网膜，研究者对MPS II（hTfR-KI/ids-KO）小鼠单次静脉注射2 mg/kg的pabinafusp alfa或非融合IDS，注射后17小时取眼球进行免疫组织化学染色，使用抗人IDS抗体检测视网膜中IDS酶的存在。同时，采用基于电化学发光法的免疫测定对视网膜中的IDS酶浓度进行定量分析。
长期疗效研究使用雄性MPS II（hTfR-KI/ids-KO）小鼠，从10周龄开始，每周一次经尾静脉注射pabinafusp alfa（0.5或2 mg/kg体重）、非融合IDS（0.5 mg/kg，即临床批准剂量）或生理盐水，持续40周。hTfR-KI小鼠作为非病理对照（正常对照）。每组分配14只动物。由于输液相关反应不严重，本研究未使用免疫抑制剂。
在给药前（基线）和给药38周后进行暗适应ERG记录。小鼠在ERG监测前一天在暗室中过夜暗适应。所有后续操作均在深红光下进行以保持暗适应。小鼠使用三种混合麻醉剂（美托咪定/咪达唑仑/布托啡诺：0.75⁄4.0/5.0 mg/kg）麻醉。用1%硫酸阿托品散瞳后，将小鼠置于Ganzfeld球体内的加热垫上。参考电极插入口腔，接地电极连接尾部，接触镜电极置于角膜中心。使用PuREC记录系统记录ERG反应。暗适应反应使用0.00001至10 cd·s/cm²的单次白光闪光刺激。结果取左眼和右眼的平均值。ERG测试按照国际临床电生理视觉学会（ISCEV）标准进行。
末次（第40次）给药后一周，小鼠在麻醉下安乐死。采集脑（视觉皮层）和眼组织进行HS浓度测定。为分离视网膜和视神经，将右眼球摘除并置于含冷PBS的培养皿中，在体视显微镜下用显微解剖剪去除眼球周围组织，切断视神经，沿锯齿缘切开，移除晶状体和角膜-虹膜，最终从RPE/脉络膜/巩膜复合体中分离出视网膜。分离的组织在-80°C以下保存。HS测定采用先前报道的液相色谱-串联质谱法进行。
小鼠在麻醉下经腹主动脉放血安乐死，随后全身灌注生理盐水。收集的眼球在10%中性缓冲福尔马林中浸泡固定，石蜡包埋并切成4 μm切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色。通过测量视网膜两侧18个位置的外核层（outer nuclear layer，ONL）厚度来评估光感受器细胞层的变化。
为从视网膜分离单细胞，将组织切成1-2 mm的小块，在含2%胎牛血清和1 mg/mL胶原酶I的PBS中37°C孵育30分钟。细胞悬液经100 μm细胞过滤器过滤后，用Muse Count & Viability试剂染色，使用Guava Muse细胞分析仪测定细胞活力和总细胞数。
数据以均数±标准误表示。使用Kyplot 6.0统计软件进行分析。正常对照（野生型）与疾病对照（KO）组间比较采用非配对t检验，治疗组间比较采用Tukey-Kramer检验。统计学显著性设定为p < 0.05。
ERG结果显示，与同龄野生型小鼠相比，MPS II小鼠的a波振幅在11周龄时即有下降趋势，并随年龄增长在统计学上变得显著。b波振幅也呈现类似趋势。b/a波比值在老年MPS II小鼠中较同龄野生型小鼠升高，表明光感受器功能受损更为明显。这些结果证实MPS II小鼠模型能够重现人类MPS II患者的视网膜变性特征。
免疫组织化学染色显示，静脉注射非融合重组人IDS后，视网膜中未检测到IDS酶的存在，这与BRB限制大分子从循环进入视网膜的认识一致。相反，静脉注射pabinafusp alfa后，在视网膜中检测到IDS酶。电化学发光法定量分析进一步证实，仅pabinafusp alfa注射后可在视网膜中测到IDS酶。这些结果确认转铁蛋白受体靶向的融合蛋白pabinafusp alfa通过穿越BRB实现了IDS酶向视网膜的递送。
40周重复给药研究显示，MPS II（KO）小鼠的视网膜、RPE/脉络膜/巩膜复合体、视神经和脑视觉皮层中HS浓度均显著升高。非融合IDS仅能降低位于BRB外的主要由RPE/脉络膜/巩膜复合体组织中的HS浓度，而对视网膜、视神经和视觉皮层中的HS浓度无显著影响。相比之下，pabinafusp alfa以剂量相关的方式降低了上述所有组织中的HS浓度。这一结果与非融合IDS不能穿越BRB、而pabinafusp alfa能够穿越BRB的药物递送特性相一致。
基线ERG测量（10周龄，治疗开始前）显示，MPS II小鼠在10 cd·s/cm²刺激下a波振幅降低，但b波正常，表明治疗开始时已存在光感受器功能缺陷，而无长突细胞/双极细胞功能尚正常。38周重复给药后，生理盐水处理的MPS II小鼠引发ERG反应所需的光刺激阈值较野生型小鼠升高，a波和b波振幅均显著降低，表明视网膜病变已经发生。非融合IDS治疗对ERG反应无影响或仅有有限影响。而pabinafusp alfa治疗的小鼠表现出与野生型小鼠相似的ERG反应。具体而言，在2 mg/kg的临床批准剂量下，a波和b波的振幅（包括二者的比值）均接近野生型水平。值得注意的是，光感受器产生的a波振幅在治疗后有相对于基线的改善（见补充图S1），并在2 mg/kg剂量下几乎正常化至野生型水平。这些结果表明，MPS II年轻小鼠中光感受器功能的缺陷是可逆的，pabinafusp alfa能够恢复该功能。
组织学分析显示，MPS II小鼠视网膜的内核层（inner nuclear layer，INL，包含无长突细胞和双极细胞）未见明显改变，但外核层（ONL，包含光感受器细胞）厚度显著减少。非融合IDS治疗的MPS II小鼠ONL厚度仅较生理盐水组有轻微增加，而2 mg/kg pabinafusp alfa治疗的小鼠ONL厚度与野生型小鼠相似。此外，生理盐水处理的MPS II小鼠视网膜中活细胞总数减少，而pabinafusp alfa（而非非融合IDS）显著抑制了视网膜细胞的丢失。这些结果表明MPS II小鼠发生了光感受器细胞（视杆和/或视锥细胞）的大量丢失，而pabinafusp alfa治疗可以预防这种丢失。
本研究证明MPS II小鼠随着年龄增长进行性地发展视网膜病变，HS在视网膜中的沉积可能是导致视网膜细胞损伤的原因。更重要的是，研究证实转铁蛋白受体靶向的IDS融合蛋白pabinafusp alfa在静脉给药后能够有效穿越BRB到达视网膜，降低视网膜内的HS水平，并在早期干预时保持甚至改善视网膜功能。这些结果为MPS II患者中具有挑战性的眼部疾病的管理提供了新的思路。
本研究的科学价值在于：首次证实了利用转铁蛋白受体介导的转胞吞作用可以穿越BRB实现酶替代疗法药物向视网膜的递送，拓展了BBB穿透策略在视网膜疾病治疗中的应用。应用价值在于：pabinafusp alfa作为一种已在日本获批用于MPS II治疗的药物，其视网膜递送能力的证实表明该药物可能同时改善MPS II患者的神经系统症状和视网膜病变，从而为患者提供更全面的治疗获益。
本研究的主要亮点包括：第一，首次证明了TfR靶向策略可以应用于穿越BRB进行视网膜药物递送，而不局限于BBB穿越。第二，通过ERG功能学检测和组织学分析相结合，全面评估了视网膜的结构和功能变化。第三，发现MPS II年轻小鼠的光感受器功能缺陷是可逆的，早期干预可以恢复正常功能。第四，研究设计涵盖了从药物递送验证到长期疗效评估的完整链条，证据层次清晰。此外，研究还发现非融合IDS虽不能穿越BRB，但可能通过作用于RPE细胞（外屏障）间接对视网膜产生一定保护作用，这一发现也为理解ERT对眼部组织的部分作用提供了新的视角。