本研究由Joseph Therriault、Marcel S. Woo、Gemma Salvadó等来自加拿大麦吉尔大学、瑞典隆德大学、瑞典哥德堡大学等多家研究机构的学者共同完成，于2023年发表在期刊 Molecular Neurodegeneration 上（2024年卷19期第2页）。

研究背景与目的 阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）的确诊依赖于死后脑组织中淀粉样蛋白-β斑块和tau蛋白神经原纤维缠结的病理发现。在活体诊断中，脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）中磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau, p-tau）的检测已成为区分AD与其他神经退行性疾病的关键生物标志物。目前，p-tau的检测主要依赖于基于抗体的免疫测定法，该方法灵敏但受限于抗体的质量和可用性，且试剂盒成本日益增高。质谱法作为一种无需抗体的技术，理论上能够在一个检测流程中实现对多个p-tau变体的绝对定量，但仪器昂贵且技术新颖。因此，本研究旨在系统性地比较基于免疫测定法和基于质谱法（特别是抗体非依赖性液相色谱-质谱联用技术）对CSF中p-tau181、p-tau217和p-tau231三种磷酸化位点的定量检测性能，评估它们在检测AD病理（以淀粉样蛋白正电子发射断层扫描和tau蛋白PET作为金标准）方面的诊断准确性、与影像学生物标志物的关联性以及两种方法之间的一致性。

详细研究流程 本研究采用了两个独立的前瞻性队列：TRIAD队列和BioFINDER-2队列，总计分析了567名参与者的数据。

1. 研究参与者与样本采集： * TRIAD队列：共纳入173名参与者，包括23名认知未受损年轻人、74名认知未受损老年人、36名轻度认知障碍患者、24名阿尔茨海默病临床综合征患者和16名其他神经退行性疾病患者。所有参与者均接受了全面的临床评估、CSF采集、[18F]AZD4694淀粉样蛋白PET和[18F]MK6240 tau蛋白PET成像。 * BioFINDER-2队列：共纳入394名参与者，包括认知未受损个体、轻度认知障碍患者、AD痴呆患者以及其他多种神经退行性疾病患者。所有参与者均接受了CSF采集、[18F]Flutemetamol淀粉样蛋白PET和[18F]RO948 tau蛋白PET成像。 * 两个队列的研究均获得了相关伦理委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书。

2. CSF生物标志物定量检测（核心实验流程）： 这是本研究的技术核心，对所有参与者的CSF样本同时进行了免疫测定法和质谱法的平行检测。 * 免疫测定法： * TRIAD队列：使用定制的单分子阵列技术，分别定量CSF中的p-tau181、p-tau217和p-tau231。 * BioFINDER-2队列：p-tau181和p-tau217使用Meso Scale Discovery平台检测，p-tau231使用酶联免疫吸附试验检测。 * 质谱法（抗体非依赖性）： * 采用统一的液相色谱-质谱联用技术对两个队列的样本进行检测。具体流程包括： 1. 样本前处理：向CSF样本中加入稳定同位素标记的肽段标准品。 2. 蛋白沉淀：使用高氯酸选择性地沉淀大部分CSF蛋白，而tau蛋白保留在上清液中。 3. 固相萃取：使用过滤板和固相萃取板纯化目标肽段。 4. 酶解：使用胰蛋白酶对样本进行过夜消化，生成特定的肽段。 5. 质谱分析：使用高分辨Orbitrap质谱仪，采用平行反应监测模式对目标磷酸化肽段进行定量。所测定的肽段长度较短（p-tau181为15个氨基酸，p-tau217为9个氨基酸，p-tau231为15个氨基酸）。 6. 数据分析：使用Skyline软件进行数据分析，通过加入已知浓度的重标肽段进行单点校准，实现绝对定量。该方法的检测限低至fmol/ml范围，精度高。

3. PET影像采集与处理： * TRIAD队列：使用[18F]AZD4694进行淀粉样蛋白PET成像，使用[18F]MK6240进行tau蛋白PET成像。通过标准化摄取值比计算淀粉样蛋白负荷和tau蛋白沉积，并定义了病理阳性阈值。 * BioFINDER-2队列：使用[18F]Flutemetamol进行淀粉样蛋白PET成像，使用[18F]RO948进行tau蛋白PET成像。采用类似方法计算标准化摄取值比。

4. 统计学分析： 研究采用了一系列统计方法来比较两种检测技术： * 组间比较：使用t检验比较淀粉样蛋白PET阳性与阴性组间的p-tau水平，并计算效应量。 * 一致性分析：使用Bland-Altman分析评估免疫测定法与质谱法测量结果的一致性。 * 相关性分析：使用Spearman相关系数评估p-tau浓度与PET生物标志物之间的关联，并比较两种方法所得相关系数的差异。 * 诊断性能评估：通过受试者工作特征曲线分析，计算曲线下面积，评估各p-tau标志物区分淀粉样蛋白PET阳性与阴性个体的诊断准确性，并使用DeLong检验比较不同方法AUC的差异。

主要研究结果 1. 两种方法测量结果的相关性与一致性： * p-tau217：在TRIAD和BioFINDER-2队列中，质谱法与免疫测定法测得的p-tau217浓度均显示出最强的线性相关性和高度一致性，尤其是在较低浓度区间。 * p-tau181：在TRIAD队列中，两种方法对p-tau181的测量相关性较弱，质谱法测得的浓度系统性低于免疫测定法，且偏差随浓度升高而增大。BioFINDER-2队列中相关性有所改善，但仍弱于p-tau217。 * p-tau231：在TRIAD队列中，两种方法测量p-tau231的相关性很强，一致性高；但在BioFINDER-2队列中，一致性相对较差。

2. 与AD病理生物标志物的关联： * p-tau217：无论是免疫测定法还是质谱法测得的p-tau217，都与淀粉样蛋白PET和tau蛋白PET的示踪剂摄取显示出强烈且统计学上无差异的相关性。这表明两种方法在捕捉AD核心病理方面对于p-tau217具有同等效力。 * p-tau181：免疫测定法测得的p-tau181与PET生物标志物的关联性显著强于质谱法测得的p-tau181。这表明质谱法检测的特定p-tau181肽段（经胰蛋白酶切割产生）可能对AD的特异性较低。 * p-tau231：在TRIAD队列中，两种方法测得的p-tau231与PET的关联性无差异；但在BioFINDER-2队列中，免疫测定法的关联性更强。

3. 诊断性能比较： * p-tau217：在TRIAD队列中，两种方法对于区分淀粉样蛋白PET阳性和阴性个体表现出同等优异的诊断性能（AUC无显著差异）。在BioFINDER-2队列中，质谱法的AUC略低于免疫测定法，但差异微小。 * p-tau181：在两个队列中，质谱法测得的p-tau181的诊断准确性均显著低于免疫测定法。 * p-tau231：在TRIAD队列中，两种方法诊断性能相当；在BioFINDER-2队列中，质谱法略逊。

结论 本研究得出以下核心结论：总体而言，基于免疫测定的p-tau生物标志物在诊断性能上略优于基于抗体非依赖性质谱法的检测。然而，具体到不同的磷酸化位点，情况有所不同： 1. 对于p-tau217：质谱法与成熟的免疫测定法在诊断性能、组间效应量以及与PET生物标志物的关联性方面高度可比。这意味着使用质谱法定量p-tau217可以成为诊断AD的可靠替代方案。 2. 对于p-tau181和p-tau231：在本研究采用的质谱法条件下，其检测性能低于相应的免疫测定法。特别是p-tau181，质谱法检测的特定短肽可能无法完全代表与AD病理最相关的tau蛋白形式。

研究意义与价值 科学价值：本研究首次在两个大型独立队列中，对三种关键磷酸化tau蛋白（p-tau181, p-tau217, p-tau231）的免疫测定法和新兴的抗体非依赖性质谱法进行了头对头的系统性比较。研究结果不仅验证了质谱法，特别是对于p-tau217检测的可行性，也揭示了检测技术（抗体依赖 vs. 抗体非依赖）和检测目标（全长/特定片段 vs. 酶解短肽）对生物标志物性能的重要影响，加深了对不同p-tau检测方法学差异的理解。 应用价值：质谱法虽然仪器昂贵、通量较低，但其核心优势在于多重检测能力——可在单次运行中同时定量多个分析物（如多种p-tau变体），这有助于减少样本用量、降低批次间变异，并可能通过分析多个磷酸化位点的模式来更精细地评估AD疾病阶段。本研究为未来在临床研究和实践中选择或开发p-tau检测方法提供了关键的数据支持。研究者也指出，质谱法有望发展成为p-tau绝对定量的候选参考方法，用于不同检测试剂的标准化。

研究亮点 1. 直接比较与验证：对当前最主流的免疫测定法和新兴的质谱法进行了全面的直接比较，数据扎实，结论具有说服力。 2. 双队列设计：使用TRIAD和BioFINDER-2两个独立、特征明确的队列进行主要分析和外部验证，增强了结果的可靠性和普适性。 3. 以PET为金标准：研究以淀粉样蛋白PET和tau蛋白PET作为AD病理的体内金标准，而非仅依赖临床诊断，使生物标志物的评估更贴近疾病本质定义。 4. 聚焦p-tau217：研究结果突显了p-tau217作为AD生物标志物的稳健性，其性能受检测技术影响较小，进一步巩固了其在AD诊断中的重要地位。 5. 指出技术特异性：研究明确指出了质谱法检测p-tau181性能不佳的可能原因（检测的短肽特异性问题），这对未来优化质谱检测方法具有重要指导意义。

其他有价值的内容 研究在讨论部分还指出了未来方向：需要在更具人群代表性的队列中验证结果，并亟需在血浆样本中比较这两种技术，因为血浆p-tau检测的便捷性使其临床应用前景更广阔。此外，研究也客观列举了质谱法和免疫测定法各自的优缺点（如成本、通量、人员技术要求等），为实际应用中的权衡提供了参考。