主要作者与发表信息
本研究由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面-头颈肿瘤科的陈岚、张杰、杨桂珠、徐成辉、薛鹏欣、赵金超、张涵、姚艳丽及孙树洋等人，联合西安交通大学化学工程与技术学院的尹琪琪、张涵、翁琳、刘涛、陈鑫等研究者共同完成。通讯作者为姚艳丽（yaoyanli@shsmu.edu.cn）、陈鑫（chenx2015@xjtu.edu.cn）和孙树洋（sunshuyang@sjtu.edu.cn）。该研究论文于2024年发表在期刊 Advanced Science 上，论文DOI为10.1002/advs.202309053，文章编号为2309053。
研究背景与目的
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是口腔黏膜上皮细胞恶性转化而形成的恶性肿瘤。尽管手术切除是OSCC的主要治疗手段，但由于口腔解剖结构复杂，肿瘤常与周围组织粘连紧密，手术往往难以彻底清除所有癌细胞。术后残留的微小肿瘤巢成为局部复发的根源。临床数据显示，约50%–70%的OSCC患者在术后8–12个月内会出现局部区域复发。此外，围手术期的炎症反应和术后免疫抑制状态还可能激活远处的微小转移灶，进一步增加治疗难度。因此，如何在术后有效清除残留癌细胞、同时重塑局部免疫微环境，成为降低OSCC复发风险的关键科学问题。
针对这一挑战，本研究旨在开发一种可植入的原位疫苗水凝胶系统，用于OSCC术后残留癌细胞的清除与免疫激活。研究团队设想，通过在手术切除后的肿瘤床内直接植入具有光热、光动力、钙干扰和免疫调节功能的水凝胶，实现对残留癌细胞的杀伤和局部免疫微环境的重编程，从而抑制复发和远处转移。
研究设计与详细流程
本研究构建了一种名为“aphp-ccca”的可植入原位疫苗水凝胶。该水凝胶由两个关键组分整合而成：第一部分（aphp）是聚多巴胺-透明质酸（polydopamine-hyaluronic acid）水凝胶，内部装载了包裹𝛿-氨基乙酰丙酸（𝛿-aminolevulinic acid, 𝛿-ALA）的PLGA纳米颗粒（𝛿-ALA@PLGA），用于提供光热治疗（photothermal therapy, PTT）和光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）。透明质酸经过多巴胺修饰（HA-DOPA）并通过酰胺化反应合成，核磁共振谱证实了其特征性苯环峰。第二部分（ccca）是钙交联的海藻酸盐水凝胶，含有共价结合抗CD47抗体（anti-CD47 antibodies, aCD47）的碳酸钙纳米颗粒（aCD47@CaCO₃），用于免疫调节。通过钙离子交联海藻酸盐和儿茶酚介导的多巴胺粘附，aphp与ccca形成互穿网络，从而整合为完整的aphp-ccca水凝胶。
在材料表征方面，研究团队利用扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射对纳米颗粒的形貌和粒径进行了分析。结果显示，荧光素钠（FS）替代𝛿-ALA制得的FS@PLGA纳米颗粒呈约500 nm的均匀球形，aCD47@CaCO₃纳米颗粒粒径约为200 nm。水凝胶内部孔径为10–20 μm，负载了足量的PLGA微球和CaCO₃纳米颗粒。通过红外热成像技术，研究团队发现aphp-ccca水凝胶在808 nm激光照射下具有显著的光热性能：在0.5 W、1.25 W和2 W功率下照射15分钟后，温度分别升高约5 °C、20 °C和40 °C。此外，𝛿-ALA的释放速率与激光功率和照射时间呈正相关，在1.25 W功率下每天照射15分钟、持续7天后，𝛿-ALA的累计释放率达到约72%。CaCO₃纳米颗粒的溶解可使局部pH在1小时内升至7.4以上，并维持超过120小时，有利于M1型巨噬细胞的活化。aCD47的累计释放率在两周内约为73%。
在细胞实验中，研究团队使用人OSCC细胞系CAL33和HN6评估了aphp-ccca的体外光热和光动力效应。结果表明，无近红外（NIR）照射时，aphp-ccca对细胞无毒性；而在808 nm激光（1.25 W cm⁻²）照射下，细胞死亡具有显著的时间依赖性。激光照射还可促进𝛿-ALA的释放，增加细胞内原卟啉IX（protoporphyrin IX, PpIX）的蓄积。在660 nm激光（40 mW cm⁻²）照射下，细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平显著升高，CAL33细胞的存活率下降至53.6%。透射电镜观察显示，经5分钟808 nm和5分钟660 nm激光照射后，CAL33细胞出现典型的凋亡形态，包括核染色质边集、凋亡小体形成及细胞崩解为300–700 nm的囊泡。
为了在体内验证aphp-ccca的疗效，研究团队建立了不完全切除的小鼠OSCC模型。将SCC7细胞接种于BALB/c小鼠右侧腹股沟皮下，待肿瘤体积达到约300 mm³时手术切除约90%的肿瘤，随后在切除部位植入水凝胶并缝合。激光照射方案为：术后第0、3、6、9、12、15天分别进行808 nm激光（1.25 W cm⁻²，5分钟）和660 nm激光（40 mW cm⁻²，5分钟）照射，共6个周期。实验分为10个处理组，包括PBS、游离aCD47、CaCO₃、𝛿-ALA+660 nm、aphp、aphp+808 nm、aphp+808+660 nm、aphp-ccca、aphp-ccca+808 nm和aphp-ccca+808+660 nm。在体内药物释放监测中，术后第一天肿瘤内pH显著升高，PpIX水平在激光照射后显著增加并维持至术后第3天，CD47的表达也在术后第4天开始下降。这些结果表明，激光照射的适当间隔时间为3天，6个照射周期可保证药物在术后瘤腔内的长期滞留。
主要研究结果
在体内抗肿瘤疗效评价中，aphp-ccca+808+660组的5只小鼠均未出现肿瘤复发，肿瘤消退率达81.86%，且在60天观察期内生存率为80%。相比之下，其他各处理组均出现不同程度的肿瘤复发。免疫组化染色显示，aphp-ccca+808+660组肿瘤组织中热休克蛋白90（HSP90）的表达较PBS组上调3.33倍，TUNEL阳性细胞和PpIX生成也显著增加，证实了PTT诱导的细胞死亡和PDT效应。此外，CaCO₃纳米颗粒降解释放的高浓度Ca²⁺导致线粒体功能障碍，表现为细胞色素c上调和Bcl-2下调。
在免疫调节方面，aphp-ccca水凝胶释放的CaCO₃可中和肿瘤酸性微环境，诱导肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）从M2型向M1型极化。流式细胞术分析显示，aphp-ccca+808+660组术后第3天M1型TAMs（CD80ʰⁱCD11b⁺F4/80⁺）比例升高，M2型TAMs（CD206ʰⁱCD11b⁺F4/80⁺）比例降低。同时，该组肿瘤微环境中IL-12水平升高、IL-10水平降低。免疫荧光和吞噬实验证实，aCD47与CaCO₃协同促进了巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。此外，aphp-ccca+808+660处理可诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），表现为钙网蛋白（calreticulin, CRT）表达升高和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的胞浆转位。术后第15天，该组引流淋巴结中成熟树突状细胞（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例最高，肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞较PBS组增加2.40倍，CD4⁺ T细胞也显著增多，而调节性T细胞（Tregs）数量降低3.5倍。血清中IL-6、IFN-𝛾、TNF-𝛼和IL-2等细胞因子水平显著升高。
在远端效应（abscopal effect）研究中，aphp-ccca+808+660治疗不仅抑制了治疗侧原发肿瘤的复发（抑制率86%），还显著抑制了未治疗的对侧远处肿瘤（抑制率83%）。外周血单个核细胞分析显示，该组小鼠CD8⁺效应记忆T细胞和中央记忆T细胞比例显著升高，成熟DC比例增加，Th2/Th1比值降低。在原位OSCC和肺转移模型中，aphp-ccca+808+660治疗使5只小鼠中4只原位舌肿瘤完全消退，肺转移灶数量较PBS组减少约15倍，中位生存期从PBS组的33天延长至69天。免疫细胞分析显示，该组外周血中NK细胞、NKT细胞和CD8⁺ T细胞数量均显著增加。
在长期免疫记忆实验中，经aphp-ccca+808+660治愈的小鼠在再次接种SCC7细胞后，30天内肿瘤生长受到明显抑制，中位生存期为63天，显著长于未治疗对照组的40天。免疫学分析显示，治愈小鼠DCs表面CD40、CD86和MHC-II表达升高，效应记忆T细胞比例增加2.4倍，肿瘤组织中CD8⁺和CD4⁺ T细胞、F4/80⁺巨噬细胞、CD19⁺ B细胞和CD27⁺记忆细胞浸润显著增加。此外，CD8⁺ T细胞的杀伤功能和增殖能力增强，PD-1、TIM-3和LAG-3等免疫检查点分子的表达下调。
在生物安全性评价中，aphp-ccca对正常口腔角质形成细胞（HOK）无毒性，植入部位周围正常组织在4周后未见慢性炎症反应，主要器官也未出现损伤。与游离aCD47原位植入或静脉注射相比，aphp-ccca+808+660组的血清IL-1𝛽、IL-6、TNF-𝛼、CCL2和MCP-1水平在治疗后6小时显著降低，血液学参数和血清生化指标均未出现明显异常，表明该系统具有良好的生物相容性和较低的全身毒性。
结论与意义
本研究成功构建了一种可植入的原位疫苗水凝胶aphp-ccca，通过整合光热治疗、光动力治疗、钙干扰治疗和免疫调节，实现了对OSCC术后残留癌细胞的有效清除和局部免疫微环境的重塑。该策略在动物模型中不仅抑制了肿瘤局部复发，还通过诱导系统性抗肿瘤免疫应答，对远处肿瘤和肺转移产生了显著的远端效应。更重要的是，aphp-ccca治疗可建立长期免疫记忆，有效抵抗肿瘤再挑战。这一研究为OSCC术后辅助治疗提供了一种新的思路：通过局部植入生物相容性水凝胶，实现时空可控的药物释放和免疫激活，从而在降低全身毒性的同时提高抗肿瘤疗效。该策略有望在未来转化为临床可用的术后干预手段，减少OSCC患者的复发和转移风险。
研究亮点
本研究的亮点主要体现在三个方面：第一，创新性地将PTT、PDT、钙干扰和免疫调节整合到单一的可植入水凝胶系统中，实现了多种治疗模式的协同作用。第二，通过优化温和光热条件（1.25 W cm⁻²、5分钟）和多次照射周期，在保证光热效果的同时最大程度保留了aCD47的抗体活性。第三，利用CaCO₃纳米颗粒的酸响应性降解释放aCD47，既中和了肿瘤酸性微环境，又实现了抗体的可控释放，避免了全身性抗体治疗可能引起的血液毒性。此外，该研究还证明局部光免疫治疗可以激发系统性抗肿瘤免疫和长期免疫记忆，为预防OSCC术后复发和远处转移提供了重要的实验依据。