这篇文章属于类型a：报告一项原创研究。

学术报告

本文的主要作者是Xiaowu Zhang和Ruibao Ren，隶属于Brandeis University的Rosenstiel Basic Medical Sciences Research Center、Department of Biochemistry和Department of Biology。研究发表在1998年11月15日的《Blood》期刊，题为“bcr-abl efficiently induces a myeloproliferative disease and production of excess interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in mice: a novel model for chronic myelogenous leukemia”。

学术背景

这项研究领域属于癌症和血液病学，聚焦于慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）的分子机制及动物模型开发。慢性髓性白血病是一种克隆性髓系增殖性疾病（clonal myeloproliferative disorder），由造血干细胞的肿瘤性转化导致，通常分三个阶段：慢性期（chronic phase）、加速期（accelerated phase）和急变期（blastic phase）。超过90%的CML病例与费城染色体（Philadelphia chromosome，Ph1）的存在相关，Ph1由染色体9号和22号之间的相互易位生成，其特征是BCR基因和Abl基因的融合，并生成一个具有异常强酪氨酸激酶活性的融合蛋白bcr-abl。bcr-abl被认为是CML发生和维持的关键，但疾病进展到急变期通常需要额外的基因突变。

现有小鼠CML模型的效率和可重复性较低，且不能全面模拟CML的病理机制，因此需要构建一个更加高效和便于实验研究的体内模型。本研究旨在通过将bcr-abl/p210融合基因引入小鼠骨髓细胞中，开发一种新型CML模型，并用以研究bcr-abl在CML中的致病机制。

研究流程

研究主要分为以下几个部分：

1. 载体构建与病毒制备
   作者构建了一个包含bcr-abl/p210融合基因和绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）的逆转录病毒载体（mscv-bcr-abl/p210-ires-gfp），载体中通过内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）实现两个基因的共表达。病毒在Bosc23细胞中通过瞬时转染产生。

2. 骨髓细胞感染与移植
   使用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）处理Balb/c雄性小鼠以富集造血干细胞，从中提取骨髓细胞，在含逆转录病毒的培养基中感染24小时后，将感染细胞移植至经致死剂量辐照的Balb/c雌性小鼠体内。

3. 疾病特征和组织病理分析
   移植后的小鼠被各时间点监控和组织取样，其中包括白细胞计数，外周血涂片分析，脏器重量测量，以及脾脏、肝脏、肺等器官的病理切片分析。

4. 实验验证和进一步探索

   • 血液学分析：通过流式细胞术分析外周血白细胞及骨髓细胞，确定双标（GFP和髓系标志物如Mac-1）细胞的比例和扩展情况。
   • 分子生物学分析：通过Southern Blot检测bcr-abl/gfp病毒插入的小鼠基因组DNA，并验证克隆特性；用RT-PCR检测IL-3和GM-CSF基因的表达；用ELISA测定小鼠血清IL-3和GM-CSF水平。
   • 突变体功能验证：构建并验证激酶失活的bcr-abl突变体（K1176R）；用突变体感染骨髓细胞并重复移植实验以观察疾病发生情况。

主要结果

1. 疾病表现与移植性
   研究发现，接受bcr-abl/p210骨髓移植的小鼠在3周内100%出现类似CML慢性期的髓系增殖性疾病，包括外周白细胞显著升高（200,000–600,000/μL），骨髓外髓样细胞扩展（如脾脏和肝脏髓样细胞浸润）及脏器肿大。这种疾病可成功移植至二级受体小鼠，且二级疾病表现为单克隆特性。

2. 突变体分析
   没有酪氨酸激酶活性的突变体K1176R未能引发疾病，表明bcr-abl的酪氨酸激酶活性对其致病性至关重要。

3. 细胞旁效应与因子表达
   实验显示，在bcr-abl移植小鼠中，未感染（GFP阴性）的髓系细胞也得到显著扩展，提示存在细胞旁效应。进一步实验发现，移植小鼠骨髓和血清中IL-3（白介素-3）和GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）水平明显升高。RT-PCR分析表明，IL-3和GM-CSF主要由感染了bcr-abl病毒的GFP阳性细胞表达。

结论与研究价值

1. 科学意义
   该研究首次开发了一种高效、可重复的体内CML模型，为CML的发病机制研究提供了有效工具。通过该模型，可更深入探讨bcr-abl相关信号通路、相互作用蛋白以及CML发病过程的潜在分子机制，特别是CML的起始和进展所需的附加突变。

2. 应用价值
   新模型的实验便利性为CML的治疗研究和药物筛选提供了理想平台；该研究还提示IL-3和GM-CSF可能在CML发病中扮演重要角色，并提出纠正异常细胞因子表达可能具有治疗潜力。

研究亮点

本研究的亮点包括：(1)使用小鼠胚胎干细胞向量（mscv）提高了bcr-abl基因在正确靶细胞中的表达效率，从而显著提升了疾病发生频率和可重复性；(2)发现bcr-abl可诱导髓源性细胞生产过量IL-3和GM-CSF，揭示了细胞因子在CML病理中的潜在作用；(3)验证了bcr-abl的激酶活性对于其在体内的致病作用是必需的。

本研究构建的新CML小鼠模型不仅为CML的基础与应用研究提供了重要工具，同时揭示了bcr-abl相关的致病机制及其可能的治疗靶点，具有重要的科学和临床意义。