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高亲和力寡核苷酸配体抑制人IgE与FcεRI结合的研究

一、研究团队与发表信息
本研究由Torsten W. Wiegand、P. Brock Williams、Stephen C. Dreskin、Marie-Helen Jouvin、Jean-Pierre Kinet和Diane Tasset共同完成，作者来自美国科罗拉多大学健康科学中心、哈佛医学院等机构。成果于1996年8月发表于*The Journal of Immunology*（DOI: 10.4049/jimmunol.157.1.221），被引用359次，是过敏性疾病治疗领域的重要文献。

二、学术背景与研究目标
IgE（免疫球蛋白E）在寄生虫防御中起关键作用，但在特应性个体中，其过度表达会导致过敏、哮喘等疾病。IgE通过与高亲和力受体FcεRI结合触发肥大细胞脱颗粒，释放组胺等炎症介质。传统干预手段（如重组肽或单抗）存在局限性。本研究利用SELEX（指数富集配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术，筛选能特异性结合IgE并阻断其与FcεRI相互作用的寡核苷酸配体，旨在开发新型过敏治疗策略。

三、研究方法与流程
1. SELEX筛选流程
- 文库设计：构建3种寡核苷酸库（2种2’-NH₂修饰的RNA库含40/60随机位点，1种ssDNA库含40随机位点），各含10¹⁵个分子。
- 结合与富集：将文库与人IgE孵育，通过硝酸纤维素膜过滤分离结合复合物，经逆转录-PCR扩增后进入下一轮筛选。经过9-15轮迭代，亲和力提升约1000倍（Kd从>50 μM降至~10 nM）。
- 克隆与测序：筛选后克隆并测序35-87个克隆，通过序列比对分为3类：2’-NH₂ RNA Group A/B和ssDNA Group。

1. 配体表征与优化

   • 亲和力测定：采用放射性标记和滤膜结合法测定Kd。代表性配体如RNA配体igel1.2（Group A, Kd=30 nM）、igel2.2（Group B, Kd=35 nM）和ssDNA配体d17.4（Kd=10 nM）。
     
   • 截断分析：通过碱水解确定最小功能序列，如igel1.2截短至35核苷酸后亲和力提高，而ssDNA配体需稳定茎环结构（如d17.4的37核苷酸截短体）。
     
   • 特异性验证：配体对啮齿类IgE或人IgG的Kd>200 μM，显示高度特异性。

2. 功能验证实验

   • 受体结合抑制：在转染人FcεRI的大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL SX-38）中，igel1.2和d17.4竞争性抑制IgE与受体结合（Ki分别为21 nM和6 nM），而igel2.2无抑制效果。
     
   • 血清素释放阻断：配体剂量依赖性地抑制IgE介导的血清素释放（IC₅₀：2-6×10⁻⁸ M），且对过敏原触发的抑制效果优于抗IgE抗体。
     
   • 竞争结合实验：igel1.2与d17.4相互完全竞争，但与igel2.2仅部分竞争，提示二者结合IgE的位点不同。

四、主要研究结果
1. 配体结构特征
- Group A RNA配体（如igel1.2）依赖5’固定区形成G-四链体结构；ssDNA配体（如d17.4）则形成茎环结构，其保守核心为21核苷酸。
- 截断实验证实，ssDNA配体的亲和力依赖茎环稳定性，如d17.1（29核苷酸，Kd=82 nM）通过延伸茎部恢复至d17.4的10 nM水平。

1. 功能差异机制

   • igel1.2和d17.4结合IgE的Ce3结构域（与FcεRI结合区重叠），而igel2.2结合邻近但不重叠的位点，解释了其无抑制活性的原因。

2. 治疗潜力验证

   • 配体在细胞模型中有效阻断IgE-FcεRI信号通路，抑制炎症介质释放，且2’-NH₂修饰增强核酸酶抗性，适合体内应用。

五、研究结论与价值
本研究首次证明寡核苷酸配体可通过高亲和力结合IgE，阻断其与受体的相互作用，从而抑制过敏反应的关键步骤。科学价值在于：
1. 揭示了IgE分子上新的药物靶点（Ce3结构域）；
2. 为核酸适配体（aptamer）在过敏治疗中的应用提供范式；
3. 通过SELEX技术获得的结构多样性配体（RNA/DNA），拓展了非抗体类抑制剂的开发思路。应用价值体现在：这类配体可发展为替代单抗的廉价、稳定的小分子药物。

六、研究亮点
1. 方法创新：首次将SELEX技术应用于IgE抑制剂的开发，并比较不同文库（长度/化学修饰）的筛选效率。
2. 结构发现：阐明G-四链体与茎环结构均可实现纳摩尔级结合，为核酸药物设计提供新见解。
3. 转化意义：配体在血清素释放实验中的高效抑制（IC₅₀达纳摩尔级），接近临床抗体药物（如奥马珠单抗）的活性水平。

七、其他重要发现
研究中发现的“孤儿序列”igel11.1（仅依赖随机区结合）提示IgE可能存在更多配体结合表位，为后续优化更高亲和力配体留下探索空间。

该报告完整覆盖了研究的背景、方法、结果与意义，特别注重对SELEX筛选流程和配体作用机制的详细解析，符合学术交流的深度要求。