本研究由医学博士 Anastasios Dimou、哲学博士 Cécile Nasarre、哲学博士 Yuri K. Peterson、理学学士 Rose Pagano、医学与哲学博士 Monika Gooz、哲学博士 Patrick Nasarre、医学博士 Harry A. Drabkin、理学硕士 Kent E. Armeson、医学博士 Barry C. Gibney、哲学博士 Robert M. Gemmill 以及医学博士 Chadrick E. Denlinger 共同完成。这些作者主要来自美国南卡罗来纳医科大学，其所属单位包括医学部肿瘤内科、外科学部心胸外科、药物发现与生物医学科学系、外科学系及公共卫生科学系等。该研究成果发表于《The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery》杂志，发表年份为2020年。
本研究所在的科学领域是肺癌的分子靶向治疗与耐药机制研究，具体聚焦于非小细胞肺癌（NSCLC）对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）产生获得性耐药的分子机理。研究的开展背景是，尽管针对表皮生长因子受体（EGFR）等特定突变基因的靶向药物（如吉非替尼、奥希替尼）显著改善了部分肺癌患者的无进展生存期，但其疗效通常只能维持数月而非数年，获得性耐药是限制其长期效果的主要瓶颈。先前研究已发现多种耐药机制，如继发突变和旁路信号激活。本研究团队前期工作观察到，在临床经TKI治疗并产生耐药的肺癌样本中，细胞表面共受体神经纤毛蛋白-2（Neuropilin-2， NRP2）的一个可变剪接异构体NRP2b表达显著上调，并与获得性耐药相关。NRP2在神经发育、血管生成及多种受体酪氨酸激酶信号通路中发挥作用，其两种异构体NRP2a和NRP2b在胞内区（C末端）序列不同，可能具有截然不同的生物学功能。基于此，本研究旨在深入探究NRP2b在促进NSCLC获得性TKI耐药中的具体功能角色及其分子机制，以期找到逆转或延缓耐药的新策略。
本研究包含多个相互关联的实验流程，详细工作流程如下：
首先，研究人员建立了细胞模型并验证了NRP2b在耐药中的作用。他们使用了多株经过验证的NSCLC细胞系，包括具有EGFR敏感突变（外显子19缺失）的PC-9和HCC827细胞，以及EGFR野生型的NCI-H322和NCI-H1703细胞。通过慢病毒转导技术，在细胞中敲低了总的NRP2，或是特异性敲低NRP2a或NRP2b异构体。核心实验之一是“药物耐受性持久性细胞”形成实验。他们将经基因改造的PC-9和HCC827细胞（每板接种10万个）置于高浓度TKI（吉非替尼2.5 µM或奥希替尼2.5 µM）中长期培养（4周或9天），然后在不含药物的培养基中恢复培养3-4周，对存活并增殖形成的克隆进行结晶紫染色和计数。另一个实验是连续药物暴露下的增殖与致敏实验。研究人员将对照或NRP2b敲低的EGFR野生型细胞（NCI-H322和NCI-H1703，每个样本25万个细胞）置于亚IC50浓度的吉非替尼（125 nM）中持续培养4周，每周计数细胞数量。这些实验旨在模拟临床长期用药后产生耐药的过程，评估NRP2b对细胞在药物压力下存活和增殖能力的影响。
其次，研究聚焦于NRP2b介导的信号通路机制。他们使用了人胚胎肾293细胞系（HEK293）构建了强力霉素诱导表达的NRP2a或NRP2b稳转株。通过蛋白质印迹法（Western Blot），分析了在诱导表达NRP2异构体后，细胞中AKT的活化状态（通过磷酸化AKT水平检测）以及PTEN的蛋白和磷酸化水平。为了探究NRP2异构体与下游分子的相互作用，研究人员进行了免疫共沉淀实验。他们在HEK293细胞中共转染带有FLAG-HA标签的NRP2a或NRP2b以及GSK3β或GFP-PTEN表达质粒，随后用抗NRP2抗体进行免疫沉淀，再通过Western Blot检测共同沉淀下来的GSK3β或PTEN。此外，为了确定NRP2b与GSK3β相互作用的关键区域，他们构建了一系列NRP2b胞内区的截短突变体（包括缺失整个胞内域的Δc，缺失最后21个氨基酸的Δ21，缺失最后6个氨基酸的Δ6），并再次通过免疫共沉淀验证这些突变体与GSK3β的结合能力。
第三，为了从结构上预测NRP2b与GSK3β的结合，研究采用了生物信息学分析方法。他们首先对NRP2b胞内区与GSK3β相互作用的15个氨基酸肽段进行了三维建模。利用MOE2018软件，将该肽段的序列与蛋白质结构数据库进行比对，发现其与某些已知的螺旋结构具有相似性，从而以此为基础构建了17个氨基酸的同源模型。随后，使用蛋白质-蛋白质刚性对接方法，将该NRP2b肽段模型与GSK3β的X射线晶体结构进行分子对接模拟，计算结合自由能并分析相互作用界面。
第四，研究人员通过功能恢复实验验证了分子机制的生物学意义。在细胞迁移实验中，他们使用了A549和PC-9细胞。将这些细胞进行NRP2总敲低或特异性敲低后，置于Transwell小室的上室，下室中加入高浓度胎牛血清作为趋化剂。上室细胞分别用肝细胞生长因子（HGF，已知可激活MET并依赖NRP2b增强信号）、GSK3β特异性抑制剂TDZD-8或两者共同处理。24小时后，对迁移到下室的细胞进行固定、染色和计数。在“药物耐受性持久性细胞”实验中，除了敲低处理，还同时加入了GSK3β抑制剂TDZD-8或蛋白酶体抑制剂MG-132，观察抑制这些关键环节能否逆转NRP2b介导的耐药表型。
研究的主要结果如下：
在耐药表型验证方面，实验结果表明，长期暴露于吉非替尼或奥希替尼的对照PC-9和HCC827细胞能够产生大量药物耐受性持久细胞克隆。然而，特异性敲低NRP2b几乎完全消除了这种克隆的形成（减少了约100倍），而敲低NRP2a反而使克隆数量增加了2至6倍以上。在EGFR野生型细胞NCI-H322中，持续吉非替尼处理下，对照组细胞仍能增殖，而NRP2b敲低细胞的增殖被显著抑制（减少了约25倍），这证实NRP2b敲低可使部分野生型细胞对TKI敏感。这些结果共同表明，NRP2b的表达对于NSCLC细胞在TKI压力下存活并形成耐药克隆是必需的，而NRP2a可能起到拮抗作用。
在分子机制探索方面，Western Blot结果显示，诱导表达NRP2b的细胞中，磷酸化AKT（Ser473）水平显著高于对照组或表达NRP2a的细胞（约2倍），同时PTEN蛋白水平明显下降，但PTEN的mRNA水平并未减少，提示PTEN的下调发生在翻译后水平。免疫共沉淀实验清晰地证明，GSK3β优先与NRP2b结合，而与NRP2a结合很弱；PTEN则主要与NRP2a强结合。使用截短突变体进行的实验将GSK3β的结合位点定位在NRP2b胞内区第881至895位的15个氨基酸区域内。生物信息学建模显示，该肽段呈两亲性α-螺旋结构，并预测其能以高亲和力（ΔG = -45 kcal）结合在GSK3β的Arg220附近。
在信号通路功能验证方面，结果显示，NRP2b敲低细胞在HGF刺激下的迁移能力被抑制，而这种迁移在敲低NRP2a的细胞中被增强。更重要的是，GSK3β抑制剂TDZD-8能够完全阻断敲低NRP2a细胞（此时NRP2b为主要异构体）的HGF诱导迁移，并能有效减少敲低NRP2a细胞在TKI处理后形成的过多耐药克隆。同时，TDZD-8和蛋白酶体抑制剂MG-132都能恢复NRP2b表达细胞中因降解而降低的PTEN蛋白水平。这些结果形成了完整的证据链：NRP2b通过其胞内区特异性地招募GSK3β，后者进而磷酸化（可能是通过NRP2a结合的）PTEN（Thr366位点），导致PTEN被泛素化并通过蛋白酶体途径降解。PTEN作为抑制PI3K/AKT通路的负调控因子，其降解会解除对AKT的抑制，从而激活促进细胞存活和迁移的AKT信号通路，最终使得肿瘤细胞能够在TKI的药物压力下存活，并逐渐发展出完全耐药。
本研究的结论是，NRP2b在非小细胞肺癌获得性TKI耐药中扮演了关键的“促进者”角色。其机制在于NRP2b特异性地与GSK3β相互作用，形成了一个信号模块，该模块导致肿瘤抑制因子PTEN的降解，从而激活促生存的AKT信号通路。因此，NRP2b-GSK3β的相互作用是连接细胞表面受体与细胞内关键耐药信号通路的关键环节。这一发现具有重要的科学价值和应用前景。从科学价值看，它阐明了NRP2两种异构体功能上的“阴阳”拮抗关系（NRP2b促耐药/迁移，NRP2a可能起保护作用），深化了对NRP2蛋白家族在癌症中复杂作用的理解，并为TKI耐药提供了一个全新的、不依赖于EGFR继发突变的非基因型依赖的机制模型。从应用价值看，该研究指出，破坏NRP2b与GSK3β之间的相互作用，可能成为一种新型的治疗策略，用以延缓或逆转NSCLC对TKIs的获得性耐药，从而延长靶向药物的有效治疗窗口。这种靶向蛋白-蛋白相互作用的策略，相较于完全敲除NRP2或GSK3β（二者均有广泛的生理功能），理论上可能具有更低的毒副作用。
本研究的亮点在于：第一，重要的发现：首次系统揭示了NRP2b异构体通过招募GSK3β导致PTEN降解进而激活AKT，从而驱动TKI获得性耐药的具体分子机制。第二，方法的综合性：研究结合了细胞生物学（耐药克隆形成、迁移）、生物化学（免疫共沉淀、Western Blot）、分子生物学（基因敲低、突变体构建）和生物信息学（分子对接模拟）等多种技术手段，从表型到机制进行了多层次、严谨的验证。第三，明确的转化前景：提出了“靶向NRP2b-GSK3β相互作用界面”这一潜在的、具有较高选择性的新型联合治疗思路。第四，对异构体功能的精细区分：强调了NRP2a和NRP2b虽源于同一基因，但功能截然不同甚至相反，这解释了以往关于NRP2在癌症中作用报道不一致的可能原因，对后续研究具有重要指导意义。
此外，文中讨论部分也提及了其他有价值的观点，例如NRP2在肿瘤相关巨噬细胞介导的胞葬作用中可能抑制抗肿瘤免疫反应，提示靶向NRP2或许还能增强免疫治疗的效果，这为未来探索联合免疫治疗提供了线索。同时，作者也坦承了研究的局限性，主要为目前尚处于体外细胞实验阶段，其体内的有效性和安全性仍需在动物模型和未来临床研究中进一步验证。最后，文章末尾的讨论实录反映了同行专家对本研究开创性工作的认可，并就其向临床转化的挑战（如靶向策略、潜在毒性、是否驱动特定耐药突变谱）进行了深入交流。