本研究发表于《Infectious Agents and Cancer》期刊2022年第17卷第9期，由Ma等人共同完成。主要作者包括Zhihai Ma、Baback Gharizadeh、Xingsheng Cai、Mengzhen Li等。通讯作者为Chunlin Wang，其所属机构为Chapter Diagnostics Inc.。该研究的合作机构还包括位于中国的Maijing Gene Medical Technology以及阿根廷国家传染病研究所-ANLIS “Dr. Malbrán”的致癌病毒服务部和性传播疾病国家参考实验室。

学术背景 本研究属于临床检验诊断学与分子流行病学交叉领域，核心关注点是性传播感染（Sexually Transmitted Infections， STI）的综合性检测。研究背景基于以下重要事实：性传播感染在全球范围内高度流行，对人类健康及公共卫生体系构成沉重负担。特别是人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus， HPV）感染，高风险的HPV（High-Risk HPV， HR-HPV）型别是宫颈癌的主要致病因素。此外，多种非HPV的性传播感染（如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒2型等）不仅本身致病，还可能通过改变免疫反应、促进病毒入侵等方式，与HPV协同作用，增加HPV持续感染、宫颈上皮内瘤变甚至宫颈癌的风险。

然而，当前的商业检测手段大多只能针对单一或少数几种病原体进行检测。为了实现全面的性传播感染筛查和研究HPV与非HPV病原体共感染的关联，临床和科研工作需要一种能够同时检测和量化多种病原体的高效工具。因此，本研究旨在开发并评估一种新型的综合检测方法——ChapterDx HPV-STI NGS（下一代测序）检测法。该方法旨在通过单管、单步的PCR（聚合酶链式反应）反应，一次性检测29种HPV型别（包括12种高危型、7种可能高危型、10种低危型）和14种非HPV的性传播病原体，并利用高通量测序平台实现从数十到数千个样本的大规模平行检测。本研究的目标是评估该检测法的检测限、特异性、灵敏度，并与其时广泛使用的Roche cobas HPV检测法进行临床样本的性能比较。

详细研究流程 本研究主要包括两个核心部分的评估工作：一是使用人工合成的标准品评估检测法的分析性能；二是使用真实临床样本评估其与现有金标准方法的一致性。

1. 分析性能评估（检测限测定）：

   • 研究对象：研究团队首先合成了覆盖43个靶标（29种HPV和14种非HPV STI）的DNA片段作为阳性对照。
   • 处理与实验：将这些合成DNA片段混合成池，并稀释成三个浓度梯度：每管100拷贝、50拷贝和20拷贝。每个浓度的对照品均添加了10 ng的人类基因组DNA以模拟真实样本背景。每个浓度分别进行了23次（100拷贝）或24次（50和20拷贝）重复检测。
   • 方法与流程：检测流程遵循ChapterDx HPV-STI NGS检测法的标准操作。主要包括：1）DNA提取：本研究使用的临床样本DNA由Roche cobas平台提取。2）单管多重PCR：在单一反应体系中，使用针对43个靶标的特异性引物以及作为内参的GAPDH基因引物进行PCR扩增。3）文库制备与测序：将扩增产物纯化后，在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。4）数据分析：使用ChapterDx分析软件对测序数据进行解码、比对（采用Smith-Waterman算法）和基因分型。判定样本为阳性的阈值设定为：针对某一靶标的特异性测序读数超过3条。

2. 临床性能验证（与Roche cobas方法比较）：

   • 研究对象：一个包含274份盲法样本的队列。这些样本先前已通过常规细胞学/组织学以及Roche cobas HPV检测进行了分析。样本的细胞学诊断结果包括：无异型增生或恶性肿瘤（NILM）102例，低级别鳞状上皮内病变（LSIL）101例，高级别鳞状上皮内病变（HSIL）57例，浸润癌5例，以及9例无细胞学结果的样本。组织学结果包括宫颈上皮内瘤变1级（CIN1）4例，CIN2/3 59例，鳞状细胞癌3例，腺癌2例。
   • 处理与实验：对这274份样本使用ChapterDx HPV-STI NGS检测法进行重新检测，以检测43种HPV和STI病原体。
   • 对比方法：使用Roche cobas HPV检测法作为参考标准，该法可单独报告HPV16和HPV18的结果，并将其余12种高危HPV型别进行混合报告。
   • 数据分析：计算两种方法在14种高危HPV、HPV16、HPV18以及其余12种HPV上的总体一致性百分比，并使用Cohen’s Kappa系数评估一致性强度。同时，统计NGS法检测到的HPV多重感染、非HPV STI感染以及HPV与非HPV STI共感染的情况。

主要研究结果 1. 分析性能结果： * 检测限：在100拷贝和50拷贝浓度下，所有43个靶标在所有重复检测中均被检出，检出率为100%。在20拷贝浓度下，34个靶标的检出率为100%（24/24），8个靶标（HPV6, 11, 39, 42, 43, 45, 56, 83）的检出率为95.8%（23/24），而生殖支原体（Mycoplasma genitalium）的检出率为87.5%（21/24）。 * 结论：根据推荐的检测限标准（在最低浓度下≥95%的重复检测为阳性），该检测法对除生殖支原体外的所有靶标在20拷贝水平均表现出可靠的检测限。生殖支原体检出率略低可能与合成DNA对照品的序列错误有关。背景样本（空白对照）未检测到任何测序读长，表明方法特异性良好，3条读长的阳性阈值设置合理。

1. 临床样本验证结果：
   • 与Roche cobas的一致性：
     • 14种高危HPV：两种方法的总体一致性为97.5%（267/274），Kappa值为0.867（非常好的一致性）。所有CIN1、CIN2/3和大部分癌症样本在两种方法中均呈高危HPV阳性。
     • HPV16和HPV18：两种方法对HPV16的总体一致性为98.5%（Kappa=0.967），对HPV18的总体一致性也为98.5%（Kappa=0.901）。仅有少数样本存在不一致，且NGS法在这些样本中检测到的HPV16读长数极低（1-2条）。
     • 其余12种高危HPV：总体一致性为96.0%（Kappa=0.906）。
   • 多重感染与共感染检测能力：
     • HPV多重感染：NGS检测法在146份样本中发现了2至12种HPV型别的共感染，详细展示了HPV感染的复杂性。
     • 非HPV STI感染：在274份样本中，共检测到205例非HPV STI感染。其中，细小脲原体（Ureaplasma parvum， 32.1%）和人型支原体（Mycoplasma hominis， 25.2%）是最常见的。52.1%的样本（143份）至少感染了7种非HPV STI中的一种，每份样本感染的非HPV STI数量在1到4种之间。
     • HPV与非HPV STI共感染：近一半的样本（49.3%， 135/274）存在HPV与非HPV STI的共感染。研究以表格形式列举了9个典型样本，展示了NGS法如何同时检出多种HPV和非HPV病原体，例如样本3同时检出了HPV16， 18， 31， 33， 45， 52， 56， 68a， 42， 61以及阴道毛滴虫和人型支原体。

研究结论与价值 本研究的结论是：ChapterDx HPV-STI NGS检测法是一种用户友好、易于自动化且经济高效的检测方法，能够为广泛的HPV和STI谱提供准确而全面的结果。 其科学价值在于：1）方法学创新：实现了对43种病原体的单管、单步PCR检测，简化了工作流程，减少了污染风险，并便于自动化。与需要多轮PCR的其他NGS-based HPV检测法相比更具优势。2）综合性：首次在一个检测中整合了如此广泛的HPV基因分型和非HPV STI检测，为研究HPV与其他STI之间的共感染模式及其在宫颈癌发生中的潜在协同作用提供了强大工具。3）高灵敏度与特异性：在低至20拷贝的浓度下对绝大多数靶标表现出优异的检测限，并与已确立的商业化检测方法（Roche cobas）高度一致。 其应用前景包括：1）临床筛查与诊断：未来经过更大规模、特征明确的队列进行临床验证后，该检测法可应用于宫颈癌筛查项目，提供更全面的感染谱信息，有助于风险分层和患者管理。2）流行病学研究：是进行大规模流行病学调查和监测研究的宝贵工具，有助于更深入地了解不同STI的流行情况、共感染模式及其与疾病进展的关联。3）病毒载量研究：该方法能对每种HPV型别进行相对定量，为研究特定HPV型别的病毒载量与疾病进展（如持续感染、癌前病变风险）的关系提供了新的可能。

研究亮点 1. 检测通量与范围的突破：本研究开发的检测法在一个反应中同时覆盖了29种HPV型别和14种非HPV STI，其检测病原体的种类和数量远超当时大多数商业化检测。 2. 方法的高效性与经济性：采用单管、单步PCR结合NGS的工作流程，显著减少了操作时间、人力和试剂成本，同时保持了高灵敏度和特异性，适合大规模样本筛查。 3. 对共感染现象的深入揭示：研究结果明确显示，在临床样本中，HPV的多重感染以及HPV与非HPV STI的共感染现象非常普遍，这突显了综合性检测在临床实践和科学研究中的必要性。 4. 与金标准方法的良好一致性：通过与广泛使用的Roche cobas HPV检测进行头对头比较，证实了新方法在检测高危HPV（特别是HPV16/18）方面的可靠性，为其后续的临床应用奠定了基础。

其他有价值的内容 研究还探讨了检测中遇到的技术细节，例如在分析性能评估中，发现HPV52合成对照DNA因存在引物区域合成错误而导致初始检测效率问题，在重新合成后得以解决，这体现了严格质量控制的重要性。此外，文中提到了某些检测到的非HPV STI（如人型支原体、脲原体属）是生殖道的共生菌，其临床意义需结合具体情境判断，这提示了未来研究需要区分致病性感染和共生定植。最后，研究提供了基于不同Illumina测序平台和试剂盒的样本通量估算，为其他实验室应用该方法提供了实用性参考。