本研究由来自瑞典隆德大学（Lund University）的John Stegmayr、Hani N. Alsafadi、Wojciech Langwiński等多名学者共同完成，合作单位包括隆德大学实验医学科学系、Wallenberg分子医学中心、干细胞中心等。研究于2020年8月以预印本形式发布于bioRxiv，标题为《Isolation of high yield and quality RNA from human precision-cut lung slices for RNA-sequencing and computational integration with larger patient cohorts》。
研究领域：本研究属于肺组织模型与转录组学交叉领域，聚焦于精准切割肺切片（Precision-Cut Lung Slices, PCLs）技术的优化及其在RNA测序（RNA-seq）中的应用。
研究动机：PCLs因能保留肺组织原生结构和细胞-基质相互作用，成为研究肺疾病和药物筛选的重要模型。然而，由于PCLs中琼脂糖（agarose）含量高，传统RNA提取方法难以获得高质量RNA，限制了RNA-seq等高通量分析的应用。
研究目标：开发一种能够从少量PCLs（包括人类疾病组织如特发性肺纤维化IPF）中高效提取高质量RNA的方法，并验证其适用于RNA-seq及后续生物信息学分析（如去卷积分析）。
3.1 三种RNA提取方法比较
1. 标准协议：使用Qiagen RNeasy Micro Kit，裂解后离心并乙醇沉淀。
2. 改良协议1：采用Trizol-氯仿相分离结合RNeasy MinElute柱纯化。
3. 改良协议2：跳过氯仿相分离，直接以Trizol裂解后加入乙醇并通过柱纯化（关键创新步骤）。
3.2 RNA质量评估
- 产量：分光光度法（Nanodrop）、荧光探针（RiboGreen、Qubit）定量。
- 纯度：A260/A280与A260/A230比值分析。
- 完整性：微流控毛细管电泳（Agilent Bioanalyzer）检测RNA完整性数（RIN）。
3.3 下游验证实验
- RT-qPCR：检测猪（HPRT）和人（RPLP0）管家基因的扩增效率。
- RNA-seq：使用Illumina TruSeq stranded mRNA文库构建，测序数据通过Hisat2比对、StringTie组装。
- 生物信息学分析：
- 去卷积分析：使用BisQue工具和IPF细胞图谱单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据预测PCLs细胞组成。
- 数据整合：通过Combat-seq校正批次效应，比较PCLs与原生组织的转录组差异。
4.1 RNA提取效率
- 改良协议2的RNA产量最高（猪PCLs达1297±125 ng），显著优于其他方法（标准协议仅50±7 ng）。
- 纯度（A260/A280≈1.67）虽低于理想值，但下游RT-qPCR显示扩增效率无显著差异（猪104.7% vs 人类108.4%）。
4.2 RNA-seq数据质量
- 各物种获得≥2600万条双端 reads，80%以上唯一比对，主要注释为蛋白质编码基因。
- 人类PCLs中预测到11,924个基因，与小鼠、猪共有10,768个基因，PCA分析显示物种间显著分离。
4.3 去卷积分析结果
- 人类PCLs中存在多种免疫细胞（如NK细胞、树突细胞），且IPF患者的PCLs中异常基底样细胞比例升高，与原生组织数据一致。
- 移植患者（Patient 1）的PCLs显示急性免疫应答特征（如B细胞增多），与临床背景吻合。
科学价值：
- 首次建立了一种适用于高琼脂糖含量PCLs的RNA提取方法，突破了RNA-seq应用的技术瓶颈。
- 通过去卷积分析揭示了PCLs中的细胞异质性，为疾病机制研究提供了新工具。
应用价值：
- 支持PCLs在药物筛选和个性化医疗中的应用，例如IPF治疗靶点验证。
- 方法可扩展至其他3D培养系统（如多糖水凝胶模型）。