双壳层壳聚糖/铁蛋白纳米笼增强EGCG稳定性、肠道转运及其抗乙肝病毒活性的研究学术报告
本研究发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊，于2026年3月26日被接收（修订于2026年2月19日，初稿提交于2025年12月12日）。该研究由南京医科大学第一附属医院感染病科的朱传龙教授团队主导完成。主要作者包括董一心、尹希智、单相如、胡一强和通讯作者朱传龙教授。
一、 研究背景与目的 本研究的科学领域集中于纳米药物递送系统与抗病毒治疗学的交叉，具体针对膳食多酚的表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG）在慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）治疗中的应用瓶颈进行创新性探索。HBV感染是全球性重大健康挑战，与肝硬化、肝细胞癌等慢性肝病密切相关。当前主流的核苷（酸）类似物疗法虽能有效抑制病毒复制，但难以实现病毒完全清除，且需长期用药，存在局限性。因此，探索能够调节宿主细胞通路以对抗病毒持久性的补充策略具有重要意义。
研究表明，HBV会诱导细胞自噬体形成，同时损害溶酶体成熟，导致“不完全自噬”，这种细胞环境有利于病毒的复制和持续感染。因此，恢复溶酶体酸化和功能性的自噬流已成为一种潜在的抗病毒干预策略。EGCG作为绿茶中的主要多酚成分，已被证实能够通过增强溶酶体酸化来对抗HBV诱导的不完全自噬，从而抑制病毒复制。然而，EGCG的治疗应用受限于其较差的化学稳定性（易氧化降解）和低肠道渗透性，导致口服生物利用度和生物效能低下。
为了克服这些障碍，纳米递送系统成为了一种有前景的策略。铁蛋白（Ferritin）是一种由24个亚基自组装形成的、具有中空笼状结构的储铁蛋白，其内径约8纳米，外径约12纳米，已被广泛研究作为生物活性物质和药物的递送载体，以改善其稳定性、生物利用度和治疗性能。铁蛋白还能通过转铁蛋白受体1（Transferrin Receptor 1, TFR1）介导的途径被细胞摄取，为跨细胞转运和细胞内递送提供了可能。然而，对于口服给药而言，铁蛋白在严苛的胃肠道环境中维持结构稳定性至关重要。壳聚糖（Chitosan, CS）是一种安全、生物相容性好的阳离子多糖，常被用作壁材以延长生物活性化合物在肠道的滞留时间，并对蛋白质具有保护作用。
基于以上背景，本研究旨在开发一种新型的双壳层纳米递送系统。该系统首先将EGCG封装于重组人H链铁蛋白（H）的空腔中，形成EGCG-铁蛋白复合物（HE），然后在外层包覆壳聚糖，最终构建出壳聚糖包被的HE双壳层纳米笼（CHE）。研究的目标是系统评估该纳米系统的理化性质、储存稳定性、胃肠道行为、跨上皮转运能力，并最终在HBV感染细胞模型（HepG2.2.15和HepaD38）中评价其抗病毒性能。研究重点在于阐明该系统通过增强溶酶体酸化和恢复自噬流以增强EGCG抗HBV活性的功能机制。通过这种集成方法，研究者希望建立一个结合胃肠道保护和机制导向的细胞内调控的递送平台，以提升EGCG抗HBV感染的功能性疗效。
二、 详细研究流程 本研究包含了纳米载体制备、表征、体外稳定性与释放评估、细胞机制研究以及抗病毒功效验证等多个紧密衔接的环节。
1. 纳米载体的制备与表征 * 重组人H链铁蛋白（H）的表达与纯化：研究首先将编码人H链铁蛋白的质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，收集菌体，裂解，并通过加热处理（60°C, 10分钟）和镍柱亲和层析法纯化得到无铁（Apo）形式的H链铁蛋白，以避免铁催化EGCG氧化。通过SDS-PAGE、透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和圆二色谱（Circular Dichroism, CD）验证了其分子量、形貌和二级结构的正确性。 * 壳聚糖包被铁蛋白（CH）的制备与优化：将纯化的H与不同质量比的壳聚糖溶液混合，并在不同pH（5.0-7.0）条件下搅拌，通过静电相互作用形成复合物。通过浊度分析、SDS-PAGE和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）系统研究了pH和质量比对复合物形成的影响。结果表明，在pH 6.0、壳聚糖与H质量比为5:1的条件下，能形成稳定的水溶性复合物。FTIR光谱显示，CH复合物中酰胺II带和酰胺III带发生位移，证实了铁蛋白羧基与壳聚糖氨基之间存在静电相互作用。 * EGCG的封装与双壳层纳米笼（CHE）的构建：采用pH触发的解组装/重装方法封装EGCG。在pH 2.0下，铁蛋白笼解离为亚基，加入过量EGCG后，再将pH调回7.0，使铁蛋白重装，从而将EGCG捕获在内腔中，形成HE。随后，按照前述优化条件，将HE与壳聚糖结合，经透析去除未结合的壳聚糖，最终得到CHE。高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）分析显示，每个铁蛋白纳米笼平均封装了约54个EGCG分子，封装效率为13.61%（w/w）。通过动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）和zeta电位分析、TEM对H、HE、CH和CHE进行了表征。HE保持了铁蛋白的笼状形貌，粒径与H相近，但zeta电位更负，表明带负电的EGCG被成功封装。CH和CHE的zeta电位变为正值，粒径显著增大至100纳米以上，TEM显示其呈聚集形态，证实了壳聚糖的成功包覆。
2. 体外稳定性与释放研究 * 储存稳定性：在25°C和4°C避光条件下，连续7天监测游离EGCG、HE和CHE中EGCG的保留率。结果显示，游离EGCG降解迅速，7天后保留率极低；HE显著提高了EGCG的稳定性；而CHE的稳定性最佳，在25°C和4°C下分别保留了71.1%和81.6%的EGCG。此外，CHE在光照、温和加热（60°C）和离心条件下也表现出对EGCG最强的保护作用。 * 模拟胃肠道释放：在模拟胃液（SGF，含胃蛋白酶）和模拟肠液（SIF，含胰蛋白酶）中评估EGCG的释放行为。游离EGCG释放最快，在SIF中累积释放率达25%。HE的释放有所延缓。而CHE的释放最为缓慢且持续，在SIF中仅释放约7%，显示出显著的缓释特性。SDS-PAGE分析表明，胃肠道消化酶会降解铁蛋白，但壳聚糖包被（CHE）为铁蛋白提供了额外的保护，增强了其稳定性，这与缓释曲线结果一致。
3. 细胞水平机制与功效研究 * 细胞毒性评估：使用CCK-8法评估EGCG、铁蛋白（H）、壳聚糖（CS）以及HE、CHE对HepG2.2.15和HepaD38细胞的毒性。结果表明，在实验浓度范围内，所有材料及制剂均未表现出明显细胞毒性，细胞活力均高于90%，确保了后续抗病毒实验结果的可靠性。 * 溶酶体酸化和自噬流分析： * 溶酶体酸化：使用吖啶橙（Acridine Orange, AO）荧光染色法检测。AO在酸性溶酶体中发出红色荧光。实验发现，EGCG处理能增强红色荧光，表明其促进了溶酶体酸化。而溶酶体碱化剂氯喹（Chloroquine, CQ）可逆转此效应。Western blot检测溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B（Cathepsin B, CTSB）的成熟形式（Mature-CTSB）。结果显示，EGCG、HE和CHE处理均能增加成熟CTSB的水平，其中CHE效果最强，且CQ共处理能抑制这种增加，证明EGCG及其纳米制剂对CTSB成熟的促进依赖于溶酶体酸化。 * 自噬流评估：通过Western blot检测自噬标志物p62和微管相关蛋白轻链3（LC3）。p62在自噬过程中被降解，其水平降低表明自噬降解活性增强。LC3-I转化为LC3-II并定位于自噬体膜，是自噬激活的标志。结果显示，EGCG处理降低了p62和LC3-II水平。HE和CHE，尤其是CHE，表现出更强的效应。当与CQ共处理时，CHE组细胞中LC3-II和p62的积累更为显著，这表明CHE促进了完整的自噬流（即自噬体形成后能与溶酶体有效融合并被降解），而不仅仅是增加了自噬体的数量。 * 直接抗病毒效应：在HepG2.2.15和HepaD38细胞中，评估不同制剂对HBV的抑制作用。qPCR检测细胞内HBV DNA和pgRNA（3.5 kb RNA）水平，ELISA检测细胞上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝e抗原（HBeAg）的分泌。结果显示，游离EGCG具有中等程度的抗病毒效果。HE的抗病毒效果优于游离EGCG。而CHE在所有指标（HBV DNA、pgRNA、HBsAg、HBeAg）上都表现出最强的抑制效果，其抑制效率接近阳性对照药物恩替卡韦（Entecavir, ETV）。单独的载体（H、CS、CH）则无显著抗病毒作用，说明活性来自于EGCG。 * 共培养模型验证肠道转运与下游抗病毒效应：建立了一个更贴近口服给药生理环境的体外模型：将分化21天、形成致密单层且跨上皮电阻（Transepithelial Electrical Resistance, TEER）值超过800 Ω•cm²的Caco-2肠上皮细胞接种于Transwell小室的上室（顶侧），将HepG2.2.15或HepaD38肝细胞接种于下室（基底侧）。将不同制剂加入顶侧，培养24小时后，检测基底侧的EGCG渗透量、TEER值变化以及基底侧肝细胞中的HBV指标。 * 转运与屏障完整性：CHE的表观渗透系数（Papp）显著高于游离EGCG和HE，表明其跨上皮转运效率最高。游离EGCG处理导致TEER值大幅下降（约45%），提示其可能破坏上皮紧密连接。而HE处理仅引起轻微且短暂的TEER变化。CHE和CH处理引起可逆的TEER下降，表明壳聚糖可能通过短暂、可逆地松弛紧密连接来增强旁细胞渗透，同时未对上皮屏障造成不可逆损伤。 * 下游抗病毒效果：收集基底侧培养基和肝细胞进行分析。结果显示，从顶侧给药后，CHE在基底侧肝细胞中展现出最强的抗HBV活性，能最有效地降低HBV DNA拷贝数和病毒抗原分泌，其效果远超等剂量的游离EGCG和HE。这直接证明了CHE通过增强EGCG的肠道吸收和转运，将更多活性成分递送至靶细胞，从而放大了其抗病毒效应。
三、 主要研究结果及其逻辑关系 1. 成功构建并表征了双壳层CHE纳米系统：结果证实，该系统具有均匀的纳米尺寸、明确的核壳结构（铁蛋白内核封装EGCG，壳聚糖外层包被），并实现了对EGCG的有效封装。这是所有后续功能研究的基础。 2. CHE显著提升了EGCG的稳定性和控制释放能力：储存稳定性实验和模拟胃肠道释放实验的数据表明，双壳层结构（壳聚糖和铁蛋白）对EGCG提供了协同保护，使其在储存和消化过程中更稳定，并能延缓其在肠道中的释放。这一结果为提高EGCG口服生物利用度提供了可能。 3. CHE在细胞水平有效增强了溶酶体酸化和促进了完整自噬流：机制研究结果显示，CHE能最有效地诱导溶酶体酸化（AO红色荧光增强）、促进CTSB成熟，并显著降低p62水平和改变LC3-II的转化/累积模式（尤其是在CQ存在下）。这些结果相互印证，形成了一个完整的证据链：CHE通过增强递送效率，使更多EGCG进入细胞，从而更有效地恢复了被HBV抑制的溶酶体功能，推动了自噬过程从“不完全”向“完全”转变。这为解释其增强的抗病毒活性提供了关键的细胞生物学机制。 4. CHE在多种HBV细胞模型中展现出卓越的抗病毒功效：无论是在直接处理肝细胞的实验中，还是在更复杂的肠道-肝脏共培养模型中，CHE都一致性地表现出最强的抑制HBV复制（DNA、pgRNA）和抗原产生（HBsAg、HBeAg）的能力。共培养模型的结果特别重要，它将“增强的肠道转运”（更高的Papp值）与“更强的下游抗病毒效果”直接关联起来，证明了该纳米系统在模拟口服吸收路径下的整体优势。 5. CHE在增强转运的同时保持了良好的生物相容性：细胞毒性实验和共培养模型中的TEER监测表明，CHE及其组分在有效浓度下无显著毒性，且对肠上皮屏障的干扰是可逆和可控的，这为其未来的体内应用提供了安全性依据。
这些结果环环相扣：制备与表征确保了体系的可靠性；稳定性与释放研究解释了其可能提升口服生物利用度的原因；细胞机制研究揭示了其作用靶点和分子通路；最终，抗病毒功效在直接细胞实验和模拟生理转运的共培养模型中得到验证，并与其增强的细胞内递送和机制调控能力相吻合。
四、 研究结论与价值 本研究成功开发了一种基于壳聚糖包被铁蛋白的双壳层纳米笼递送系统（CHE），用于口服递送抗HBV多酚EGCG。该系统整合了铁蛋白的精准封装与TFR1介导的细胞摄取优势，以及壳聚糖的胃肠道保护、黏膜粘附和可逆打开紧密连接的能力。
结论：CHE能显著提高EGCG的物理化学稳定性和胃肠道滞留时间，实现其缓释，并有效增强其跨肠上皮细胞的转运效率。在机制上，CHE通过促进溶酶体酸化和恢复功能性自噬流，逆转了HBV诱导的有利于病毒生存的细胞状态。最终，这些特性共同导致CHE在体外模型中表现出远超游离EGCG和单层铁蛋白载体（HE）的抗HBV活性。
价值： 1. 科学价值：本研究不仅报道了一种新型纳米递送平台，更重要的是，它将“纳米载体设计”与“宿主导向抗病毒疗法”的机制深度结合。研究清晰地阐明了从“提高递送效率”到“调控特定细胞通路（溶酶体/自噬）”，再到“实现增强疗效”的完整逻辑链条，为开发基于膳食成分的宿主靶向抗病毒纳米药物提供了概念验证和范例。 2. 应用价值：该研究为解决EGCG等具有治疗潜力但理化性质不佳、生物利用度低的天然产物在临床应用中的瓶颈问题，提供了一条切实可行的技术路径。双壳层设计思路（蛋白质内核+多糖外壳）具有普适性，可拓展至其他多酚或疏水性活性物质的递送。尽管本研究尚处于细胞水平，但其结果为后续的动物实验和临床前开发奠定了坚实的基础。
五、 研究亮点 1. 创新的双壳层设计：将铁蛋白的精确封装与细胞靶向能力，与壳聚糖的胃肠道保护和促渗透功能相结合，构建了一个功能互补的协同递送系统。 2. 机制驱动的功效验证：研究超越了简单的“递送-效果”关联，深入探究了纳米制剂如何通过调控“溶酶体酸化-自噬流”这一特定宿主细胞通路来发挥增强的抗病毒作用，使研究具有显著的深度和机制洞察力。 3. 采用生理相关的共培养模型：引入Caco-2/HepG2.2.15 (或HepaD38) 共培养Transwell模型，模拟了口服给药后的“肠道吸收-肝脏作用”连续过程，使体外抗病毒评价更具生理相关性和预测价值，结论也更为有力。 4. 系统性与完整性：研究涵盖了从材料制备、理化表征、体外稳定性、细胞摄取与机制到最终抗病毒功效评价的全链条，数据翔实，逻辑严密，构成了一项完整且高质量的纳米医学研究。
六、 其他有价值的内容 研究团队使用了无铁形式的重组人H链铁蛋白，这一细节非常重要。因为它避免了天然铁蛋白中可能存在的铁离子在生理条件下催化EGCG发生氧化反应、产生活性氧，从而干扰实验结果或引发额外细胞毒性的问题。这体现了实验设计的严谨性。此外，研究中的所有实验均设置了充分的对照（如游离EGCG、空载体H、CH等），确保了结果的可靠性和结论的针对性。文章也明确指出，该研究为细胞水平的原理验证，后续的体内代谢、分布及长期安全性有待进一步探索，这种表述科学而审慎。