关于《柱前衍生HPLC法测定虫草金钱龟口服液中15种氨基酸的含量》研究的学术报告
本研究由广西梧州制药（集团）股份有限公司的谭舒舒、张兆佳、覃丽燕、徐梨及梁云飞共同完成，以题为《柱前衍生HPLC法测定虫草金钱龟口服液中15种氨基酸的含量》的论文形式，发表于2025年第41卷第2期的《轻工科技》（*Light Industry Science and Technology*）期刊上。
本研究隶属于药物分析学与中药质量标准控制领域。其学术背景源于对传统中成药质量控制的现代化与精准化需求。虫草金钱龟口服液是广西梧州制药（集团）股份有限公司的独家产品，由冬虫夏草、龟、鸡等十二味中药精制而成，具有补益气血、补肾益精的功效，用于气血两亏、肾精亏虚等多种症状。口服液中富含多种氨基酸，是体现其营养与药效价值的重要指标成分之一。然而，该产品现行的质量标准中，含量测定项仅以丙氨酸为指标，采用紫外分光光度法测定总氨基酸含量。该方法不仅步骤繁琐（涉及过柱、碱洗等），且无法提供各种具体氨基酸的组成与含量信息，难以全面、精确地评价产品的内在质量。因此，建立一个能够同时测定多种氨基酸、操作简便、结果准确的定量分析方法，对于提升虫草金钱龟口服液的质量控制水平、保证产品批次间稳定性和疗效可靠性具有迫切的现实意义。本研究的核心目标即是开发并验证一种基于柱前衍生高效液相色谱（Precolumn Derivatization High Performance Liquid Chromatography, HPLC）技术的新方法，用以同时、快速、准确地测定虫草金钱龟口服液中15种氨基酸的含量，并为该品种的质量标准升级提供科学依据和数据支持。
研究的工作流程严谨而详细，主要包含以下几个关键步骤：
首先，是仪器与试剂准备。研究团队配备了包括十万分之一电子天平、水浴锅、超声波清洗器及高效液相色谱仪在内的全套分析设备。关键的试剂包括三批次的虫草金钱龟口服液样品（批号：22120201, 22120202, 23040101），以及从中国食品药品检定研究院购得的15种高纯度氨基酸对照品，涵盖了天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。衍生化试剂则选用了分析级的异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, PITC）和三乙胺。
其次，是色谱条件的建立与优化。这是方法开发的核心。研究团队采用了Welch Ultimate Amino Acid专用氨基酸分析柱（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）。流动相系统由A相（100 mmol/L醋酸钠缓冲液，pH 6.5）和B相（乙腈-水混合液，体积比80:20）组成，采用精心设计的梯度洗脱程序，在80分钟内实现15种氨基酸的完全分离。色谱条件设置为流速1.0 mL/min，柱温40°C，检测波长254 nm（针对PITC衍生化后的氨基酸衍生物）。该梯度洗脱程序（如表1所示）是经过优化的关键，它确保了从极性较大的天门冬氨酸、谷氨酸到极性较小的苯丙氨酸、赖氨酸等所有目标组分都能在合理时间内获得良好的色谱峰形与分离度。
第三，是溶液的制备。这包括：1）混合对照品溶液的制备：精确称取各氨基酸对照品，用0.1 mol/L盐酸溶解定容，得到各单标储备液。然后混合各储备液，依次加入三乙胺乙腈溶液和PITC乙腈溶液进行柱前衍生化反应（室温，1小时），反应后用乙腈-水（50:50）定容。此溶液再用正己烷萃取以除去过量衍生试剂，下层溶液用含2%乙腈的水溶液稀释后，经0.22 µm滤膜过滤，即得。2）供试品溶液的制备：取口服液样品，用0.1 mol/L盐酸稀释后，加入6 mol/L盐酸，于120°C水解6小时，以将蛋白质和多肽中的氨基酸完全释放。水解液蒸干去除盐酸，残渣用0.1 mol/L盐酸溶解定容得到储备液。取储备液进行与对照品相同的衍生化、萃取和稀释步骤。3）空白溶液的制备：除不加入口服液样品外，其余步骤与供试品溶液制备完全相同，用于评估基质干扰。
第四，是系统的方法学验证。这是确认方法是否科学、可靠、可用的必经环节。研究团队设计并执行了一系列严谨的实验：1）专属性试验：通过对比分析空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图（见图1），证实供试品中15种氨基酸的色谱峰保留时间与对照品完全一致，且空白溶液无干扰，表明方法具有高度专一性。2）线性关系、检测限与定量限试验：将混合对照品溶液稀释成一系列浓度，进样分析，以浓度（x）对峰面积（y）进行线性回归。结果显示，所有15种氨基酸在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）均在0.9996以上。同时测定了各氨基酸的信噪比S/N=3和S/N=10时对应的浓度，分别作为方法的检测限（LOD, 0.011~0.156 µg/mL）和定量限（LOQ, 0.036~0.208 µg/mL），表明方法灵敏度高。3）精密度试验：连续6次进样同一混合对照品溶液，计算各氨基酸峰面积的相对标准偏差（RSD%），结果均在0.02%~0.40%之间，证明仪器精密度优异。4）稳定性试验：将同一份供试品溶液在室温下放置0、4、8、12小时分别进样测定，各氨基酸峰面积的RSD%在0.49%~2.99%之间，表明供试品溶液在12小时内稳定。5）重复性试验：平行制备6份供试品溶液进行测定，各氨基酸含量的RSD%在0.54%~2.91%之间，表明方法重复性良好。6）加样回收率试验：采用加样回收法评估准确度。在已知含量的供试品储备液中加入已知量的氨基酸对照品，然后按法处理测定。计算得到的15种氨基酸的平均加样回收率在93.5%至102.2%之间，RSD%均小于3.0%（见表3），证明方法准确度令人满意。
最后，是样品的实际测定。应用所建立并已验证的方法，对三批虫草金钱龟口服液商品样品（批号：22120201, 22120202, 23040101）进行含量测定，成功获得了每批样品中15种氨基酸的具体含量数据（见表4），例如丙氨酸含量在5.43~5.87 mg/mL之间。
本研究获得的主要结果体现在方法学验证数据和样品测定数据两方面。在方法学上，所有验证项目——专属性、线性、精密度、稳定性、重复性和准确度——的结果均完全符合甚至优于药物分析领域对于定量分析方法的常规要求标准。尤其是15种氨基酸在50分钟内实现了基线分离（见图1），线性相关系数极高，加样回收率接近100%且偏差小，这些数据强有力地证明了所建立的柱前衍生HPLC方法具有优异的分离能力、灵敏度、精密度和准确度。在样品应用上，对三批产品的测定结果（表4）不仅提供了迄今为止关于虫草金钱龟口服液氨基酸组成最详尽的数据谱图，还直接验证了该方法的实用性。一个关键发现是，三批样品中丙氨酸的含量（折算后约为162.9 ~ 176.1 mg/瓶，具体取决于产品规格，文中未明确单位制但指出远高于标准）均“远远大于”现行质量标准规定的80.0 mg阈值。这一结果从侧面印证了原标准方法的局限性，并凸显了新方法提供更全面质量信息的价值。这些结果环环相扣：方法学验证的成功是样品准确定量的前提；而成功的样品测定则最终实现了研究的最初目标——建立并应用一个可靠的方法来获取口服液中多种氨基酸的真实含量。
基于以上工作和结果，本研究得出明确结论：成功开发并验证了一种基于异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生结合高效液相色谱（HPLC）的分析方法。该方法能够在50分钟内实现虫草金钱龟口服液中15种氨基酸的良好分离与同步准确定量。经过全面的方法学验证，证实该方法专属性强、线性范围宽、精密度和准确度高、重复性和稳定性好。因此，该方法可以作为虫草金钱龟口服液中多种氨基酸含量测定的有效手段，用于产品的质量控制。
本研究的价值与意义重大。在科学价值层面，它将现代药物分析技术（柱前衍生HPLC）成功应用于传统复方中药制剂复杂成分的定量分析，为中药多组分、多指标质量评价提供了具体的技术范例。在应用价值层面，该方法直接服务于生产实践，能够替代原有繁琐且信息量不足的紫外分光光度法，为虫草金钱龟口服液建立更科学、更严格、更全面的质量控制标准提供了坚实的技术支撑，有助于保障该中成药产品的安全、有效和质量均一，从而维护患者利益并提升产品市场竞争力。研究还指出，未来可基于中药组方“君臣佐使”理论，继续考察口服液中其他药材的指标成分，从而构建更完整的质量控制体系。
本研究的亮点突出。首先，在研究目标上，针对具体产品（虫草金钱龟口服液）现行质量标准的不足，提出了精准的改进方案，具有很强的针对性和应用导向。其次，在研究方法上，并非简单套用现有文献方法，而是进行了关键优化。例如，在溶剂选择上，研究发现直接使用50%乙腈水溶液作为进样溶剂会产生“溶剂效应”，导致某些氨基酸（如苯丙氨酸、谷氨酸）出现双峰，而采用先以50%乙腈水溶解，再以2%乙腈水稀释的方案，则有效避免了这一问题，保证了定量的准确性。这一细节体现了研究的严谨性和创新性。最后，在研究成果上，不仅提供了一套完整、可靠、经过验证的分析方法流程，还首次系统揭示了虫草金钱龟口服液中15种氨基酸的含量数据谱，为该产品的物质基础研究和质量标准提升贡献了核心数据。
此外，研究在“讨论”部分还提及了有价值的信息：初期曾尝试建立同时测定20种氨基酸的方法，但在测定口服液样品时发现仅含有其中15种，因此最终将方法锁定于这15种。这说明了方法开发中的务实调整，也间接反映了该产品特定的氨基酸组成特征。研究展望部分强调了对其他药材指标成分进行后续考察的计划，体现了构建全面质量标准体系的系统思维。