学术研究报告：硒介导的(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯动态变化及其在富硒茯茶黄酮类化合物生物合成中的作用机制研究
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由来自陕西科技大学食品科学与工程学院的郭爱爱、贾伟*和王鑫共同完成。通讯作者为贾伟。该研究以题为“Selenium-Mediated (−)-Epigallocatechin-3-Gallate Dynamics via Flavanone-3-Hydroxylase Regulation of Flavonoid Biosynthesis in Fu Tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)”的论文形式，发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊2024年第72卷，页码为13769至13784。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于食品科学、植物代谢组学与营养化学的交叉领域。硒是人体必需的微量元素，但摄入不足或过量均会带来健康风险。茶树（Camellia sinensis）是一种具有强硒富集能力的植物，富硒茶被认为是一种安全、适度的膳食硒补充来源。茯茶是一种具有悠久历史的中国发酵茶，以其独特的抗氧化和消食解腻特性著称。然而，尽管已知硒会影响植物的次级代谢，但硒胁迫下，特别是对于茯茶这种发酵茶，其关键活性成分（如儿茶素、茶多酚）的合成与代谢变化机制，以及硒在茶叶中的具体转化形态和健康关联，尚不明确。
因此，本研究旨在：（1）系统探究不同硒含量对茯茶中代谢物谱，特别是黄酮类化合物（如儿茶素）生物合成途径的影响；（2）鉴定富硒茯茶中新型的硒形态（如硒肽）；（3）阐明硒介导的茯茶关键品质成分（如茶多酚、氨基酸、咖啡碱）动态变化的潜在分子机制；（4）为富硒茶的质量评估和硒的生物可利用性研究提供理论依据。
三、 详细研究流程
本研究采用了结合非靶向代谢组学、靶向定量分析和肽组学的综合策略，详细流程如下：
1. 样品制备与分组： 研究选取了产自中国陕西安康的茯茶样品。通过测定茶叶硒含量，根据富硒茶标准（0.25-4.00 mg kg⁻¹），选取了四种不同硒含量的茯茶样品作为研究对象，其硒浓度分别为：0.0 mg kg⁻¹（普通茯茶对照）、0.6 mg kg⁻¹、1.2 mg kg⁻¹和2.4 mg kg⁻¹。
2. 代谢物提取与非靶向代谢组学分析： * 提取方法： 将茶粉（0.5 g）用甲醇/水（70/30, v/v）溶液在70°C下浸提30分钟，离心取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后备用。同时制备混合所有样本提取液的质量控制（QC）样本以评估仪器稳定性。 * 分析平台： 采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS−MS/MS）进行分析。色谱分离使用Hypersil Gold C18色谱柱，质谱采用电喷雾离子源（ESI），在正负离子模式下进行全扫描和数据依赖的二级扫描（dd-MS2）。 * 数据处理与化合物鉴定： 这是本研究的创新点之一。研究团队采用了结合Word2Vec算法和分层导航小世界图（Hierarchical Navigable Small World graphs, HNSW）的计算策略，以实现对茯茶代谢物结构信息的高效、精准匹配注释。 * 原理： 首先，利用从ChEMBL和NIST数据库中获取的分子结构信息作为输入，通过神经电子-电离质谱（NEIMS）模型生成预测质谱图。 * Word2Vec嵌入： 将实验获得的质谱图碎片信息（如“peak@ 121”代表m/z 121.02865的C7H5O2⁺碎片）转换为向量表示（嵌入），这类似于自然语言处理中将词语转化为向量。 * HNSW索引与快速检索： 将预测谱图的嵌入向量构建成HNSW索引（一种高效的近似最近邻搜索数据结构），使得能够快速在海量谱库中检索到与实验谱图最相似的分子结构网络。 * 优势： 该方法显著提高了质谱匹配的速度和准确性，降低了假阴性率，从而更可靠地鉴定出茯茶中复杂的代谢物。
3. 靶向定量代谢组学验证： 为了精确量化关键代谢物的变化，研究建立了基于UHPLC-MS/MS的靶向定量方法。该方法针对儿茶素、黄酮类、有机酸、酚类、生物碱、氨基酸等共22种化合物进行了方法学验证，包括线性范围、相关系数（R² > 0.9989）、回收率（90.67–108.34%）、日内/日间精密度（RSD < 15%）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。这确保了后续定量数据的可靠性。
4. 肽组学分析以鉴定硒肽： 为了探究硒在茶叶蛋白/肽中的结合形态，研究进行了肽组学分析。 * 样品前处理： 使用甲醇/水提取茶粉，经超滤离心脱盐、固相萃取（SPL）净化后，进行质谱分析。 * 分析鉴定： 使用Thermo Scientific Hypersil Gold AQ极性封端C18色谱柱进行分离，在正离子模式下进行UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析。利用MaxQuant软件对原始质谱数据进行数据库检索（UniProt数据库），并设定1%的假发现率（FDR）进行肽段筛选。通过PeptideRanker评估已鉴定肽段的潜在生物活性，并与生物活性肽数据库（如EROP-Moscow, PlantPepDB, Biopep）进行比对。
5. 数据分析流程： * 代谢组学数据分析： 使用Compound Discoverer软件进行峰提取和化合物鉴定。将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0和KEGG数据库进行通路富集分析。采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行多变量统计分析，以观察不同硒含量样本间的整体代谢差异，并筛选出变量重要性投影（VIP）> 1.0且p值 < 0.05的显著差异代谢物。使用GraphPad Prism进行单变量统计（t检验或ANOVA）。 * 肽组学数据分析： 如前述，使用MaxQuant进行肽段鉴定和蛋白质推断。
四、 主要研究结果
1. 代谢物谱的全局变化与关键通路识别： PCA和PLS-DA模型（R²Y = 0.7741， Q² = 0.6969）清晰地将四种不同硒含量的茯茶样本区分开，表明硒处理显著改变了茯茶的代谢轮廓。研究共鉴定出93种显著变化的代谢物，主要类别为儿茶素、黄酮类、有机酸、酚类和萜类。KEGG通路富集分析显示，黄酮和黄酮醇生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、黄酮类生物合成等途径是硒影响最显著的代谢途径。这直接表明硒干预的核心靶点之一是黄酮类化合物的生物合成网络。
2. 硒在茯茶中的转化机制与新型硒形态的发现： * 良性硒醇类似物的形成： 研究指出，在高硒胁迫下，茶树可能通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）催化内源性亚硒酸盐与还原型谷胱甘肽（GSH）的巯基结合，生成谷胱甘肽硒醇（Glutathioselenol） 等物质，以缓解氧化应激。这类似于谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的催化循环，将有毒的氢过氧化物转化为无害的醇类。 * 新型硒肽的鉴定： 通过肽组学分析，研究首次在富硒茯茶中鉴定出一种新型硒肽，其序列为Pro-Arg-SeMet-Trp（分子量m/z 636.22571）。该肽段含有硒代蛋氨酸（SeMet）。质谱碎片离子分析确认了其结构，PeptideRanker预测其具有较高的生物活性潜力（得分0.977），且ToxinPred预测显示其无毒性。这为富硒茶的健康功效提供了新的潜在活性物质线索。
3. 硒介导的茶多酚动态变化与分子机制： 定量分析揭示了硒含量对儿茶素水平的复杂影响： * (-)-表没食子儿茶素（EGC）： 随着硒含量升高（至2.4 mg kg⁻¹），其含量从13.26 mg kg⁻¹显著下降至11.19 mg kg⁻¹。 * (-)-儿茶素没食子酸酯（CG）、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）和(+)-没食子儿茶素（GC）： 在0.6和1.2 mg kg⁻¹硒处理组中含量显著降低，但在2.4 mg kg⁻¹的高硒组中含量显著回升并高于对照组（CG：10.95 升至 12.19 mg kg⁻¹；EGCG：14.98 升至 18.55 mg kg⁻¹；GC：16.54 升至 18.38 mg kg⁻¹）。 * 机制阐释： 研究将这种变化与黄酮类生物合成途径关联。黄烷酮-3-羟化酶（F3H）是柚皮素向下游二氢黄酮醇转化的关键酶。硒可能通过调节F3H以及下游的类黄酮3‘-羟化酶（F3’H）、类黄酮3‘,5’-羟化酶（F3‘5’H）和类黄酮合酶（FLS）的活性，影响儿茶素和黃酮醇苷的合成流向。例如，高硒（2.4 mg kg⁻¹）促进了EGCG的积累，这可能与其更强的自由基清除能力有关，是植物应对硒诱导氧化应激的一种适应性反应。同时，研究也提到，纳米硒处理可通过抑制CsANR和CsSCPL1a等儿茶素合成相关基因的表达来降低EGCG含量，提示硒的形态和浓度效应复杂。
4. 硒对其他关键品质成分的影响： * N5-乙基-L-谷氨酰胺（茶氨酸的主要组分）： 其含量与硒含量呈显著负相关，从11.63 mg kg⁻¹下降至4.26 mg kg⁻¹（降幅达63.4%）。推测硒可能通过下调茶氨酸合成酶（TS）或上调谷氨酰胺合成酶（GS）的表达，影响谷氨酸向茶氨酸的转化，从而降低茶叶鲜爽味。 * 咖啡碱： 含量随硒含量增加而显著下降（从10.37降至7.27 mg kg⁻¹），这与之前的研究一致。硒可能通过影响AMP脱氨酶（AMPD）和腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）等咖啡碱合成关键酶的活性来减少其积累，从而降低茶叶苦味。 * 黄酮醇苷： 硒处理增加了杨梅素-3-半乳糖苷和夏佛塔苷的含量。这涉及UDP-葡萄糖：类黄酮-3-O-糖基转移酶（如CsUGT78A15）和环化糖基转移酶（CGT）的催化活性，糖苷化反应有助于改善茶叶风味。
五、 研究结论与价值
本研究系统揭示了硒在富硒茯茶中转化、积累及其对关键风味与功能成分生物合成的调控机制。 1. 科学价值： * 机制新见解： 明确了硒主要通过调控黄酮类生物合成途径（尤其是F3H相关分支）来影响儿茶素的组成和含量，并揭示了硒对茶氨酸和咖啡碱合成的抑制作用。 * 形态新发现： 首次在富硒茯茶中鉴定出新型硒肽（Pro-Arg-SeMet-Trp），拓展了对茶叶中有机硒存在形态的认识。 * 方法学创新： 成功应用结合Word2Vec和HNSW的计算代谢组学策略，实现了复杂基质中代谢物的高效精准注释。 * 双重角色阐释： 阐明了硒在茶树中的双重角色——既是潜在的氧化应激诱导因子（需通过合成谷胱甘肽硒醇等来解毒），又是品质代谢的调节信号。 2. 应用价值： * 品质调控指导： 为通过硒营养强化技术定向调控茶叶品质（如降低苦味、调整儿茶素比例）提供了理论依据。 * 产品开发与评估： 为开发安全、健康且风味优化的富硒茶产品（如富硒茯茶）提供了科学支撑，并为建立更完善的富硒茶质量评估体系（不仅看总硒，还需关注硒形态及关键成分谱）奠定了基础。 * 安全性提示： 研究表明，适量硒富集（本研究中2.4 mg kg⁻¹）可以提升部分有益多酚含量，但会降低茶氨酸，这为平衡硒富集茶的营养与风味提供了参考。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究还简要讨论了硒在植物中的吸收同化途径（通过硫酸盐转运蛋白，经ATP硫酸化酶（ATPS）等转化为有机硒），以及硒形态（有机硒 vs. 无机硒）与生物利用度、安全性的关系，为理解本研究背景提供了更广阔的视角。此外，文中提到的通过减小茶叶粒径以提高富硒茶抗氧化活性及利用率，以及利用富硒茶参与合成硒纳米颗粒等思路，展示了该研究成果潜在的外延应用方向。