急性髓系白血病中NAT10介导的mRNA N4-乙酰胞苷通过重编程丝氨酸代谢驱动白血病发生与干细胞特性
本研究由Subo Zhang（张苏博）、Feng Huang（黄锋）、Yushuai Wang（王玉帅）、Yifei Long（龙一飞）等来自中山大学、上海交通大学、辛辛那提大学等多家研究机构的联合团队完成。研究成果于2024年12月发表于国际顶级期刊 Nature Cell Biology 第26卷。
一、 研究的学术背景
本研究聚焦于急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukaemia， AML）的发病机制。AML是一种起源于造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells， HSPCs）的高度侵袭性血液系统恶性肿瘤，其发生发展受到遗传突变和非遗传异常的共同驱动。近年来，RNA修饰作为一种重要的转录后调控机制，在AML代谢重组和异常增殖中的作用日益受到关注，例如N6-甲基腺苷（m6A）。然而，另一种重要的RNA修饰——N4-乙酰胞苷（ac4C）——在AML中的功能尚不明确。
ac4C是唯一已知存在于真核生物RNA中的乙酰化修饰，其形成由N-乙酰转移酶10（NAT10）催化。过去认为ac4C主要存在于rRNA和tRNA中，但近期研究发现NAT10也可催化mRNA上的ac4C，从而调控mRNA的翻译效率。尽管ac4C在实体瘤中的作用已初步揭示，其在白血病中的角色仍是空白。与此同时，代谢重组是AML的显著特征之一，其中丝氨酸作为一种条件必需氨基酸，对于白血病干细胞（Leukaemic Stem Cells, LSCs）或白血病起始细胞（Leukaemia-Initiating Cells, LICs）的生存和自我更新至关重要。阻断丝氨酸摄取或合成通路已显示出抗白血病潜力。
基于以上背景，本研究旨在探究以下科学问题：ac4C修饰及其“书写器”NAT10是否在AML中发挥作用？其具体机制是什么？NAT10是否可作为AML治疗的潜在靶点？本研究的目标是阐明NAT10/ac4C轴在AML发生发展中的功能与机制，并探索靶向NAT10的临床治疗前景。
二、 详细的研究流程
本研究采用了多层次、多组学的系统性研究策略，流程复杂且环环相扣，主要包含以下关键步骤：
初始筛选与靶点鉴定：
- 研究对象： 利用癌症依赖图谱（DepMap）数据库中24株人AML细胞系的CRISPR-Cas9筛选数据。
- 实验与分析： 分析了232个RNA表观遗传调控因子的依赖性得分（Ceres score）。通过生信分析发现，RNA表观调控因子整体对于AML细胞生存更为关键。其中，ac4C的书写酶NAT10的Ceres得分（-1.3）低于多个已知重要的m6A书写酶，表明其可能是AML的关键癌基因。进一步的临床数据分析显示，NAT10在AML患者中高表达，且与不良预后相关。
NAT10在AML中的功能验证（体内与体外）：
- 研究对象： （A）小鼠模型：MLL-AF9癌基因转导的小鼠造血干/祖细胞，移植入致死剂量辐照的受体小鼠，构建原发性AML模型。（B）细胞系：人AML细胞系（如MOLM13, MonoMac6, Kasumi-1）。（C）基因工程小鼠：构建了Nat10条件性敲除小鼠（Nat10fl/flCreERT2, 简称Nat10-CKO）。
- 实验方法：
- 功能丧失： 在MLL-AF9模型中，使用短发夹RNA（shRNA）敲低Nat10，或利用他莫昔芬诱导Nat10-CKO小鼠的HSPCs中Nat10敲除，然后评估其对小鼠生存期、外周血/骨髓中原始细胞比例、脏器浸润（脾、肝）以及脾肿大的影响。
- 功能获得： 在低表达Nat10的Kasumi-1细胞中过表达野生型Nat10（Nat10-WT）或其突变体（催化失活型G641E， RNA结合域缺失型ΔHelicase）。
- 干细胞特性评估： 通过集落形成实验（CFA）、体外及体内极限稀释实验（LDA）来评估Nat10缺失或过表达对LSCs/LICs自我更新能力的影响。
- 数据工作流： 生存分析采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验；细胞计数、集落数等采用t检验或Mann-Whitney U检验；LDA分析采用卡方检验。
多组学分析揭示NAT10调控丝氨酸代谢：
- 研究对象： NAT10敲低与对照的MOLM13细胞。
- 实验方法：
- 转录组学（RNA-seq）： 鉴定差异表达基因（DEGs），并进行基因集富集分析（GSEA）和基因本体（GO）分析。
- 代谢组学： 采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行：（a）全局非标记代谢物检测；（b）稳定同位素示踪（使用U-13C-葡萄糖），分析代谢通量。
- 荧光定量分析： 检测细胞内总丝氨酸水平、丝氨酸摄取和从头合成速率。
- 数据分析： RNA-seq差异基因鉴定采用Wald检验（经Benjamini-Hochberg校正）。代谢通路影响分析采用超几何检验。
机制探究一：NAT10通过ac4C修饰促进丝氨酸摄取
- 研究方法：
- ac4C全转录组图谱绘制： 开发并应用了“优化的乙酰化RNA免疫沉淀测序”（refined acetylated RNA immunoprecipitation sequencing， RACRIP-seq）。该方法的核心创新在于引入了一个体外转录的无修饰RNA对照文库（IVT control），通过系统校准，有效消除了抗体非特异性结合造成的假阳性信号，从而鉴定出高可靠性的ac4C峰（本研究最终得到5,296个可靠峰）。
- 靶点验证： 对候选靶点丝氨酸转运蛋白SLC1A4的mRNA，进行acRIP-qPCR验证ac4C修饰水平，RIP-qPCR验证NAT10直接结合，Western blot验证蛋白水平，多聚核糖体图谱分析（Polysome Profiling）验证翻译效率。
- 功能回复实验： 在Nat10敲低的AML细胞或Nat10敲除的小鼠HSPCs中，重新过表达SLC1A4，观察是否能挽救细胞生长、集落形成及丝氨酸摄取缺陷。
- 蛋白质组学（TMT定量）： 在Nat10敲低细胞中进行，全局分析蛋白表达变化，并比较有/无ac4C修饰的mRNA所对应蛋白质的下调程度。
机制探究二：NAT10通过ac4C修饰促进丝氨酸合成
- 研究方法：
- 靶点筛选与验证： 从RACRIP-seq鉴定的低乙酰化基因中，聚焦于转录调控相关基因。结合公共数据库相关性分析，锁定转录因子HOXA9和组蛋白修饰阅读器MENIN。通过acRIP-qPCR、RIP-qPCR、Western blot、多聚核糖体图谱验证其为NAT10的直接ac4C翻译增强靶点。
- 下游通路解析： 在HOXA9或MENIN敲低的细胞中，通过RNA-seq、RT-qPCR、Western blot验证丝氨酸合成通路（SSP）关键基因（PHGDH， PSAT1， PSPH）的表达下调。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和CUT&RUN技术，证实HOXA9和MENIN直接结合于这些SSP基因的启动子区。
- 功能回复实验： 在Nat10敲低或敲除的模型中，过表达HOXA9或MENIN，观察是否能挽救细胞增殖、集落形成、LSCs活性以及丝氨酸合成水平。
NAT10作为治疗靶点的探索与验证
- 临床相关性分析： 利用多个公共数据库（TCGA， MILE study， GSE76008等）分析NAT10在AML患者不同亚型、不同细胞群体（如CD34+ LSCs vs. 非LSCs）中的表达水平及其与预后的关系。
- 靶点上游调控机制： 利用已发表的ChIP-seq数据及自行进行的CUT&RUN实验，证明MLL融合蛋白（如MLL-AF9）能直接结合并转录激活NAT10的启动子，解释了其在MLL重排AML中高表达的原因。
- 药物筛选与机制验证：
- 抑制剂筛选： 测试了已知NAT10抑制剂Remodelin及多个FDA批准药物。通过细胞增殖实验（MTT法）发现氟达拉滨（Fludarabine）和Remodelin能有效抑制AML细胞系和原代AML细胞生长，且对健康供者外周血单个核细胞毒性较低。
- 作用机制验证： 采用分子对接模拟、药物亲和反应靶点稳定性实验（DARTS）、细胞热位移实验（CETSA）证明氟达拉滨及其活性代谢物F-ara-ATP能直接与NAT10的乙酰辅酶A结合口袋结合，抑制其活性。进而证实氟达拉滨处理可降低细胞ac4C水平、下调NAT10靶蛋白（SLC1A4， HOXA9， MENIN）表达、减少细胞内丝氨酸。
- 体内药效评估： 建立C1498小鼠同系AML模型，腹腔注射氟达拉滨或Remodelin，评估其对小鼠生存期和脾肿大的改善作用。
- 克服耐药性探索： 在携带MENIN抑制剂（如Revumenib）耐药突变（M327I， G331R）的AML细胞中，测试氟达拉滨和Remodelin，发现它们依然有效，提示靶向NAT10可能是一种克服MENIN抑制剂耐药的新策略。
三、 主要研究结果
NAT10是AML发生和LSCs自我更新所必需的： DepMap筛选显示NAT10是AML的脆弱性基因。在小鼠AML模型中，敲低或敲除Nat10能显著延长受体鼠生存期，减少白血病负荷和脏器浸润，并严重损害LSCs/LICs的自我更新能力（CFA和LDA显示频率大幅下降）。在人AML细胞系中敲低NAT10也抑制增殖并诱导凋亡。
NAT10通过重编程丝氨酸代谢发挥功能： 转录组和代谢组学联合分析发现，敲低NAT10导致与丝氨酸/甘氨酸/苏氨酸代谢相关的基因和代谢物显著下调。同位素示踪和功能实验证实，NAT10缺失同时抑制了细胞对丝氨酸的摄取和其从头合成。
NAT10的致癌功能依赖于其RNA乙酰转移酶活性： 敲低NAT10显著降低RNA ac4C水平，但不影响组蛋白及非组蛋白的乙酰化。过表达催化失活型（G641E）或RNA结合缺陷型（ΔHelicase）NAT10突变体，无法像野生型那样促进细胞增殖、集落形成或丝氨酸代谢。这证明NAT10主要通过催化RNA的ac4C修饰来发挥功能。
NAT10通过ac4C增强SLC1A4翻译促进丝氨酸摄取： RACRIP-seq绘制了MOLM13细胞的ac4C修饰图谱，并鉴定出SLC1A4 mRNA是NAT10的直接靶点。NAT10缺失导致SLC1A4 mRNA的ac4C修饰减少、翻译效率下降（多聚核糖体占比降低），进而蛋白水平降低，丝氨酸摄取受阻。过表达SLC1A4能部分挽救Nat10缺失导致的细胞生长缺陷。
NAT10通过ac4C增强HOXA9/MENIN翻译激活丝氨酸合成通路： RACRIP-seq和验证实验表明，转录调控因子HOXA9和MENIN也是NAT10的直接ac4C翻译增强靶点。NAT10缺失导致HOXA9和MENIN蛋白下调。HOXA9和MENIN能直接结合并激活丝氨酸合成通路（SSP）基因（PHGDH， PSAT1， PSPH）的转录。敲低HOXA9或MENIN会抑制SSP基因表达和丝氨酸合成。过表达HOXA9或MENIN能挽救Nat10缺失导致的细胞表型和LSCs功能缺陷。
NAT10在AML中高表达且是良好治疗靶点： 分析显示NAT10在AML患者（尤其是MLL重排和FLT3-ITD突变亚型）及CD34+ LSCs中高表达，且与不良预后相关。MLL融合蛋白可直接上调NAT10转录。
氟达拉滨是NAT10的有效抑制剂： 氟达拉滨及其活性代谢物能直接结合并抑制NAT10活性，降低ac4C水平和丝氨酸代谢，有效抑制AML细胞生长。在AML小鼠模型中，氟达拉滨和Remodelin治疗能显著延长生存期。值得注意的是，氟达拉滨对携带MENIN抑制剂耐药突变的AML细胞同样有效。
四、 研究结论与意义
本研究的核心结论是：在急性髓系白血病中，RNA修饰酶NAT10通过催化mRNA上的ac4C修饰，双重调控丝氨酸代谢——一方面增强丝氨酸转运蛋白SLC1A4的翻译以促进摄取，另一方面增强转录因子HOXA9和MENIN的翻译以激活丝氨酸从头合成通路，从而共同满足白血病细胞（尤其是白血病干细胞）对丝氨酸的成瘾性需求，驱动白血病发生并维持干细胞特性。
其科学价值在于： 1. 首次系统阐明了ac4C修饰在AML中的关键作用，将RNA表观遗传学、代谢重组和白血病干细胞生物学三个重要领域紧密联系起来，揭示了AML发病的新机制。 2. 深入解析了NAT10通过ac4C精细调控基因表达的分子逻辑，即同时作用于代谢物转运（SLC1A4）和转录调控枢纽（HOXA9/MENIN），形成协同放大效应，高效重编程核心代谢通路。 3. 发现了临床老药氟达拉滨的新靶点和新机制，即其可通过抑制NAT10发挥抗白血病作用，为氟达拉滨的临床应用提供了新的理论依据。 4. 提出了靶向NAT10治疗AML（包括克服MENIN抑制剂耐药）的新策略，具有明确的转化医学前景。
五、 研究亮点
- 研究视角新颖： 聚焦于尚未被充分研究的ac4C修饰在血液肿瘤中的作用，选题具有前沿性。
- 技术方法创新： 开发并应用了高特异性的RACRIP-seq方法，显著提高了ac4C全转录组检测的可靠性，为该领域研究提供了重要工具。
- 机制阐释深刻： 不仅发现了NAT10/ac4C的功能，更通过多组学整合和严谨的功能回复实验，清晰地勾勒出“NAT10 → ac4C → 翻译增强（SLC1A4， HOXA9/MENIN）→ 代谢重组（丝氨酸摄取/合成）→ 白血病发生与干细胞维持”的完整信号轴，逻辑链条严密。
- 转化意义突出： 成功将基础研究发现（NAT10是关键靶点）与临床可用药物（氟达拉滨）及临床耐药难题（MENIN抑制剂耐药）相结合，体现了从“实验室到临床”的转化研究思路。
- 研究体系完备： 综合运用了生物信息学筛选、基因工程小鼠模型、细胞系模型、原代患者样本、多组学分析、分子/生化实验、体内药效评价等多种手段，证据层次丰富，结论坚实可信。
六、 其他有价值内容
本研究还通过蛋白质组学分析发现，拥有ac4C修饰的mRNA，其编码的蛋白质在Nat10敲低后下调程度显著高于无ac4C修饰的mRNA，进一步强有力地证明了ac4C对mRNA翻译的选择性增强作用。此外，研究也探讨了Nat10可能通过rRNA ac4C影响全局翻译，以及通过tRNA ac4C影响特定氨基酸解码的可能性，但数据表明mRNA ac4C的选择性翻译调控在其致癌功能中占主导地位，这为理解不同层次RNA修饰的功能分工提供了线索。