基于主客体相互作用辅助的纳米孔传感肽测序技术研究

一、研究团队与发表信息
本研究由中国科学院化学研究所的吴海臣（Hai-Chen Wu）团队主导，主要作者包括张云（Yun Zhang）、易亚坤（Yakun Yi）、李子怡（Ziyi Li）等，合作单位包括中国科学院高能物理研究所。研究成果于2024年1月发表于Nature Methods（Volume 21, Pages 102–109），标题为《Peptide sequencing based on host–guest interaction-assisted nanopore sensing》，DOI: 10.1038/s41592-023-02095-4。

二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于蛋白质组学与单分子传感交叉领域，聚焦于蛋白质测序技术的创新。
研究动机：现有蛋白质测序技术（如Edman降解和质谱法）存在灵敏度低、动态范围窄、无法识别翻译后修饰等局限性。相比之下，纳米孔技术因其在DNA测序中的成功应用备受关注，但蛋白质的20种氨基酸化学多样性及电荷异质性导致信号分辨困难。
研究目标：开发一种基于酶切和主客体相互作用辅助的纳米孔传感新方法，实现对肽链的精准测序，并区分所有20种蛋白源性氨基酸。

三、研究流程与方法
1. 氨基酸识别探针设计
- 探针结构：设计肽探针FGXD8（含N端苯丙氨酸F、甘氨酸G、待测氨基酸X及8个天冬氨酸D尾部），利用葫芦[7]脲（CB[7]）与F的主客体相互作用，延长肽链在α-溶血素（αHL）纳米孔中的滞留时间。
- 实验验证：通过单通道电流记录，发现FGXD8⊂CB[7]复合物穿过αHL时产生的电流阻塞信号（I/I₀）可区分X的身份。优化探针长度（D8尾）和X的位置（第三位）后，20种氨基酸被分为14组，部分重叠信号通过αHL突变体（如M113F）进一步区分，最终实现100%准确率（最大重叠仅27.8%）。

1. 游离氨基酸耦联与识别

   • 耦联反应：将羧肽酶切割的游离氨基酸通过SPDP linker连接到探针FGGCD8的第四位半胱氨酸（C）上，形成FGGCC(X)D8⊂CB[7]。
     
   • 信号优化：利用αHL突变体（M113G、M113R）及pH调节（pH 4.0）解决部分氨基酸信号重叠问题（如异亮氨酸I与亮氨酸L的区分）。
     

2. 肽链测序验证

   • 酶切策略：
     
     • 混合酶切：使用羧肽酶A（CPA）和B（CPB）消化模型肽（如Pep1: Ac-RRRRRPVGLRSY），通过监测不同时间点切割产物的电流信号丰度推断序列（C端氨基酸先被切割，信号占比更高）。
       
     • 分步酶切：针对长肽（Pep3），交替使用低浓度CPA和CPB逐步切割，结合超滤分离和纳米孔检测，实现15个氨基酸的序列测定。
       
   • 数据验证：结果与质谱测序一致，且成功区分传统质谱难以分辨的I/L。
     

四、主要结果与逻辑关联
1. 氨基酸特异性识别：
- FGXD8探针在αHL中产生的电流阻塞信号与氨基酸极性显著相关（带电氨基酸如R/E/K信号最深，非极性如F/V最浅），而非传统认为的体积效应。
- 突变体M113F将分辨率提升至单氨基酸水平（图1g-h）。

1. 肽测序可行性：
   
   • 混合酶切策略通过时间依赖的信号丰度比（如Pep1中Y/S/R/L/G的积分面积比）反推序列（图4b-d）。
     
   • 分步酶切策略通过控制酶活性和反应时间，逐步释放氨基酸，避免信号混淆（图4e）。
     

五、研究结论与价值
1. 科学价值：
- 首次将主客体化学与纳米孔传感结合，提出“酶切-耦联-纳米孔检测”的肽测序新范式。
- 突破现有技术对氨基酸种类和翻译后修饰的检测限制，为单分子蛋白质测序奠定基础。

1. 应用潜力：
   
   • 可扩展至翻译后修饰检测（如磷酸化、糖基化）。
     
   • 未来通过微流控整合酶切、耦联和检测步骤，有望实现高通量自动化测序。
     

六、研究亮点
1. 方法创新：
- 利用CB[7]与F的瞬时结合实现肽链在纳米孔中的可控滞留，解决了传统纳米孔技术信号瞬态的难题。
- 设计FGGCD8探针耦联游离氨基酸，将测序问题转化为氨基酸识别问题。

1. 技术突破：
   
   • 单次实验区分20种氨基酸，准确率远超现有荧光测序技术（仅能识别少数氨基酸）。
     
   • 分步酶切策略显著提升测序长度（>10个氨基酸），优于混合酶切的“信号脱相”限制。
     

七、其他重要内容
1. 局限性：当前检测限为10–60 pmol，与Edman降解相当，需进一步提高灵敏度。
2. 未来方向：优化酶切同步性、开发集成化微流控设备、探索氨基肽酶的应用以拓展N端测序能力。

（全文约2000字）