关于人类视网膜及其类器官细胞类型的单细胞分辨率研究学术报告
本研究由Cameron S. Cowan, Magdalena Renner, Martina De Gennaro, Guglielmo Roma, Florian Nigsch, Botond Roska等人领衔，主要研究机构包括瑞士巴塞尔分子与临床眼科研究所、巴塞尔弗里德里希·米歇尔生物医学研究所、诺华生物医学研究所、巴塞尔大学眼科系等。该研究成果以“Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution”为题，于2020年9月17日发表在《Cell》期刊（第182卷，1623–1640页）。
一、 研究背景 本研究属于干细胞生物学、发育生物学、眼科学和单细胞组学交叉领域。人类器官类器官（Organoids）作为体外三维培养体系，能够模拟目标器官的部分形态、功能和转录组特征，为基础和转化研究提供了宝贵平台。然而，一个关键的科学问题是：类器官中的细胞类型在转录组水平上，究竟在多大程度上、以及何时能够趋同于其模拟的成年器官的细胞类型？这种趋同性对于利用类器官模拟成人疾病至关重要。此外，许多视网膜疾病（如视网膜色素变性、黄斑变性）具有明确的遗传基础，但其致病基因在成年人类视网膜具体细胞类型中的表达谱尚不完整，尤其是在功能完整的人体组织中。
人类视网膜是一个高度分层的神经组织，包含多种特化的神经元（如光感受器、双极细胞、神经节细胞）和非神经元细胞（如米勒胶质细胞、视网膜色素上皮细胞）。以往对成人视网膜的单细胞转录组研究，多依赖于死后数小时处于缺血状态的供体组织，而缺血会在短时间内对视网膜造成不可逆的损伤，可能严重影响转录组的真实性。同时，尽管已有研究报道了具有光敏感性的视网膜类器官，但能够形成功能性突触、并具备多层结构以快速传递光信号的类器官仍有待开发。因此，本研究旨在：1）开发一种能够大规模生产、具有光敏感性、多层结构及功能性突触的人类视网膜类器官；2）建立并比较功能完整的成年人类视网膜与类器官在单细胞分辨率下的转录组图谱；3）明确类器官细胞类型向成年视网膜细胞类型的转录组趋同过程；4）绘制视网膜疾病相关基因在成年视网膜及类器官特定细胞类型中的表达图谱。
二、 详细研究流程 本研究包含一个系统且环环相扣的工作流程，主要可分为以下几个核心步骤：
1. 多层光响应性人类视网膜类器官的开发与规模化生产 * 研究材料： 筛选了23个人类诱导多能干细胞系，最终主要使用01F49I-N-B7和IMR90.4两个iPSC系。 * 方法流程： * 类器官生成优化： 研究团队开发了一种名为AMASS的新方法。首先，使用琼脂糖微孔阵列从确定数量的解离iPSCs中生成大小均一的拟胚体，将变异性降低了4.7倍，并能通过控制每孔接种细胞数来控制拟胚体大小。随后，在二维培养形成视杯样结构后，采用“棋盘格刮取法”替代传统耗时的显微解剖，将类器官产量从单个6孔板孔提高了数倍，实现了高通量生产（每孔可产生约3700个类器官）。 * 结构与功能验证： 对生成的类器官进行了详细的组织学和功能分析。免疫组化染色和电子显微镜证实了类器官具有与成人视网膜相似的三层核层（外核层、内核层、节细胞层）和两层突触层（外网状层、内网状层），并观察到了光感受器的外节、连接纤毛、内节等亚细胞结构以及带状突触的形成。通过腺相关病毒载体在类器官中表达钙离子传感器GCaMP6s，并结合双光子激光成像，研究人员首次在人类视网膜类器官中记录到了光感受器对光刺激的超极化反应，以及通过功能性突触快速（毫秒级）将光信号传递至内核层和节细胞层的“OFF”型神经元。这证明了类器官不仅具有形态学上的分层结构，还具备了功能性神经回路。
2. 视网膜类器官发育过程的单细胞转录组时序分析 * 研究对象： 从F49B7 iPSC系生成的视网膜类器官，在发育的第6、12、18、24、30、38和46周共7个时间点进行采样。 * 方法流程： 使用10x Genomics Chromium平台对总计110,862个单细胞进行了RNA测序。通过深度学习算法scVis将不同时间点的细胞转录组嵌入二维图谱进行可视化。使用Jensen-Shannon散度量化不同时间点转录组分布的差异，以评估类器官发育的稳定性。此外，研究还构建了一个线性模型，利用已发表的人类视网膜发育（7-20周）的批量转录组数据来预测类器官的“视网膜等效发育年龄”，从而比较体外与体内发育速率。
3. 功能完整的成年人类视网膜样本的获取与单细胞转录组测序 * 研究对象： 来自多器官捐献者的成人眼球。研究团队设计了一套关键程序以最大程度减少缺血损伤：在捐献者死亡后，通过快速手术和眼杯制备，结合供氧灌注运输装置，将视网膜经历的缺血窗口期缩短至5分钟以内。 * 方法流程： * 功能验证： 使用高密度微电极阵列记录视网膜神经节细胞对光刺激的电活动。结果显示，82%的记录细胞对光刺激有显著反应，并观察到包括ON/OFF、瞬态/持续反应在内的多种反应类型，且峰值放电频率高，证明所获取的视网膜在多个环路水平上功能完整。 * 单细胞测序： 从功能验证后的视网膜（包括周边部、中央凹、视网膜色素上皮和脉络膜）以及类器官（30和38周）中分离单细胞，进行大规模单细胞RNA测序。总计分析了285,441个细胞的转录组（类器官110,862个；成人视网膜174,579个，其中周边部74,558个，中央凹22,150个）。 * 数据分析： 使用Infomap算法对单细胞转录组进行分层聚类，鉴定转录组定义的细胞类型。通过UMAP进行降维可视化。通过计算不确定性系数，将转录组定义的细胞类型与已知的标记基因定义的细胞类型进行比对。
4. 类器官与成人视网膜细胞类型的比较与疾病基因图谱绘制 * 方法流程： * 转录组趋同性分析： 首先训练一个分类器，以区分周边部和中央凹视网膜的细胞。将该分类器应用于类器官细胞，判断其转录组更接近哪一区域。其次，对于每种细胞类型，计算类器官细胞与成人周边部视网膜对应细胞类型在Top 200标记基因表达上的欧几里得距离，并转换为Z分数，定量评估其相似性。 * 缺血影响分析： 为了验证快速获取样本的重要性，研究还对同一供体视网膜在死后不同时间点（20分钟至9小时）进行了单细胞测序，评估缺血对转录组的动态影响。 * 疾病基因图谱绘制： 针对10种非综合征性视网膜疾病（如色盲、先天性静止性夜盲、视网膜色素变性、Leber先天性黑矇、黄斑变性等）和2种综合征性疾病（Usher综合征、Bardet-Biedl综合征），将已知的疾病相关基因映射到成年视网膜和类器官的特定细胞类型上，创建“疾病图谱”。同时，分析了这些基因在类器官发育过程中的表达时序。
三、 主要研究结果 1. 类器官发育在转录组上于30-38周达到稳定“发育完成”状态，且发育速率与体内相似。 * 时序图谱显示有序分化： scVis图谱揭示了细胞从多能祖细胞向分化视网膜细胞类型的转录组进展轨迹。神经视网膜细胞的出现顺序为：神经节细胞、光感受器前体细胞、水平细胞、无长突细胞、双极细胞、米勒胶质细胞。值得注意的是，神经节细胞在12-18周丰富，但在24周后变得罕见。 * 发育稳定性： Jensen-Shannon散度分析表明，同一批次、相同周龄的类器官个体间转录组差异很小（D_JS < 0.1）。不同周龄类器官间的差异在30周和38周之间达到最小（D_JS = 0.093），表明转录组在此时间窗内趋于稳定。46周的类器官显示出细胞类型多样性和部分标记基因表达的下降，表明过度培养可能导致退化。因此，将30-38周的类器官定义为“发育完成的类器官”。 * 发育速率匹配： 线性模型预测的类器官“视网膜等效发育年龄”与其实际培养年龄高度一致，表明类器官在体外的发育速率与人类视网膜在体内的发育速率相似。
2. 成功建立了功能完整的成人人类视网膜单细胞转录组图谱，并揭示了缺血对转录组的快速影响。 * 高质量图谱： 从缺血时间分钟的功能性视网膜中，鉴定出65种转录组定义的细胞类型（周边部53种，中央凹41种），涵盖了所有已知的视网膜神经元类别（如视杆/视锥细胞、水平细胞、10种双极细胞、17种无长突细胞、5种神经节细胞）和非神经元细胞（米勒细胞、星形胶质细胞、色素上皮细胞、脉络膜黑色素细胞、免疫细胞、血管细胞等）。 * 缺血导致快速转录组改变： 时序缺血实验证明，大多数神经元细胞类型（视杆/视锥、水平细胞、双极细胞等）的基因表达在死后3小时内即发生显著变化，其变化幅度甚至接近不同但密切相关的细胞类型之间的差异。一些细胞类型（如HC_02型水平细胞）对缺血尤为敏感。这一发现强调了使用最小缺血损伤组织获取真实体内转录组状态的重要性。
3. 发育完成的视网膜类器官在细胞类型组成和转录组特征上更接近成人周边部视网膜，而非中央凹。 * 细胞类型组成相似性： 类器官含有40种细胞类型，其中32种与成人视网膜中的细胞类型一致。类器官包含了成人视网膜中大多数神经元细胞类型，包括视杆细胞、S/L/M视锥细胞、水平细胞、全部10种双极细胞类型以及17种无长突细胞中的14种。但未检测到免疫细胞、血管相关细胞和脉络膜细胞类型。 * 转录组趋同于周边部： 分类器分析显示，类器官细胞的转录组被显著预测为更接近周边部视网膜。细胞类型组成相关性分析也显示，类器官与周边部视网膜高度相关，而与中央凹相关性弱且不显著。 * 定量相似性评估： 基于标记基因表达距离的Z分数分析表明，尽管类器官细胞类型的整体分布与成人周边部视网膜不完全重叠，但除少数类型（如ACb_11无长突细胞、RPE）外，大多数类器官细胞类型都有细胞落在成人对应细胞类型的分布范围内，表明存在相当程度的转录组趋同。
4. 绘制了视网膜疾病相关基因的细胞类型特异性表达图谱，并证明类器官保留了这种特异性。 * 疾病具有细胞类型特异性： 研究发现，大多数具有遗传关联的视网膜疾病，其相关基因的表达具有高度的细胞类型特异性。例如，与年龄相关性黄斑变性相关的基因（如CFH、TIMP3）主要在视网膜色素上皮细胞和脉络膜细胞中高表达。 * 类器官保留疾病基因表达模式： 在发育完成的类器官中，疾病相关基因的细胞类型特异性表达模式与成人周边部视网膜基本相似。这为利用患者来源或基因编辑的类器官研究疾病机制提供了重要依据。 * 区域特异性表达提示疾病机制： 研究发现，一些疾病基因（如Stargardt病相关基因ABCA4）在周边部和中央凹视网膜的特定细胞类型（如色素上皮细胞）中表达存在差异，这可能解释了某些疾病（如Stargardt病）的区域特异性（黄斑受累）。 * 表达时序： 类器官中疾病基因的表达时序各异，有些持续表达，有些随发育上调或下调，这为在类器官中模拟不同发病年龄的疾病提供了时间窗口参考。
四、 研究结论与价值 本研究成功地开发并规模化生产了具有光响应性和功能性突触的人类视网膜类器官，并首次在单细胞分辨率上系统比较了其与功能完整的成年人类视网膜的转录组图谱。核心结论是：人类视网膜类器官在体外发育至30-38周时达到一个稳定的“发育完成”状态，其细胞类型的转录组特征趋同于成人周边部视网膜的对应细胞类型，并且保留了视网膜疾病相关基因的细胞类型特异性表达模式。
科学价值： 1. 提供了高质量参考图谱： 建立了首个基于功能完整、最小缺血损伤的成人人类视网膜（包括周边部、中央凹、RPE和脉络膜）以及发育时序性视网膜类器官的单细胞转录组图谱，是视网膜生物学和疾病研究的宝贵资源。 2. 阐明了类器官的模拟能力与局限： 明确了当前视网膜类器官在模拟成人视网膜（特别是周边部）细胞类型转录组方面的能力，也指出了其缺乏中央凹特异性、血管和免疫系统等局限性，为未来类器官模型的改进指明了方向。 3. 揭示了缺血对视网膜转录组的动态影响： 强调了快速获取组织对获得真实体内状态转录组数据的重要性，为未来基于人体组织的研究设立了新标准。 4. 构建了视网膜疾病的细胞类型解析图谱： 将疾病基因精准定位到具体的视网膜细胞类型，深化了对疾病发病细胞基础的理解，为针对特定细胞类型的基因治疗（如使用细胞类型特异性启动子的AAV载体）提供了直接靶点。
应用价值： 1. 疾病建模平台： 所建立的高通量类器官生产方法（AMASS）和具有高度再现性的类器官体系，为利用患者来源或基因编辑的iPSC构建视网膜疾病模型、进行药物筛选和机制研究提供了强大工具。 2. 治疗策略指导： 疾病图谱有助于重新思考某些疾病的治疗策略。例如，Stargardt病可能源于中央凹特异性色素上皮细胞的功能障碍，提示治疗需同时靶向光感受器和色素上皮细胞。 3. 未来研究基石： 该图谱可作为“地面实况”，用于解读未来从糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等常见视网膜疾病患者组织中获得的单细胞数据，从而在细胞类型水平解析疾病病理机制。
五、 研究亮点 1. 方法学创新： 开发了AMASS方法实现视网膜类器官的规模化、标准化生产；建立了将成人视网膜缺血窗口期缩短至5分钟以内并保持其光响应功能的完整流程，为获取高质量人体组织样本树立了标杆。 2. 系统性与深度： 研究不仅停留在类器官的构建，而是通过大规模的时序单细胞测序，动态、定量地描绘了类器官发育轨迹及其与体内发育的匹配度，并与功能完整的成人视网膜进行了全面、深入的比较。 3. 功能与结构验证并重： 不仅通过转录组学鉴定细胞类型，还通过电生理、钙成像、免疫组化、电镜等多层次技术，证实了类器官具备功能性神经回路和成熟的亚细胞结构。 4. 重要的科学发现： 首次明确揭示了视网膜类器官细胞转录组向成人周边部视网膜的趋同；绘制了首个基于功能完整视网膜的疾病基因细胞类型特异性图谱；量化证明了缺血对视网膜转录组的快速且显著的影响。 5. 资源开放性： 研究产生的所有测序数据、计数表和图谱均已公开，为全球视网膜研究社区提供了极其宝贵的资源。
六、 其他有价值的内容 研究还比较了类器官与成人视网膜在细胞形态和定位上的异同，发现类器官中大多数细胞类型的胞体大小与成人视网膜相近，但也存在一些细胞错位现象。此外，研究通过比较F49B7和IMR90.4两个iPSC系生成的类器官，展示了该方法在不同细胞系间的可重复性。这些细节进一步丰富了人们对类器官模型的认识。