本研究由Simon Boudreault, Victoria E. S. Armero, Michelle S. Scott, Jean-Pierre Perreault和Martin Bisaillon* 完成，研究团队主要来自加拿大舍布鲁克大学（Université de Sherbrooke）的医学院与健康科学学院生物化学系。该研究成果于2019年发表在《Virology Journal》期刊上。
这项研究的学术背景聚焦于病毒学与宿主细胞分子生物学的交叉领域，特别是选择性剪接（Alternative Splicing, AS）在病毒-宿主相互作用及致癌过程中的调控作用。选择性剪接是真核生物中增加蛋白质组多样性的关键mRNA成熟步骤，超过90%的人类基因经历此过程。AS的失调与包括癌症在内的多种疾病密切相关。尽管已知多种病毒可以干扰宿主细胞的AS，但关于致癌病毒（特别是疱疹病毒）如何通过调节AS来促进其致癌性的机制理解仍然有限。爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）与多种癌症相关，而其核抗原1（EBNA1）是唯一在所有EBV相关恶性肿瘤中均持续表达的病毒蛋白。此前有证据表明EBV的SM蛋白和EBER非编码RNA能够影响细胞AS，但EBNA1在此方面的作用尚不明确。研究团队先前的工作发现，在EBV阳性胃癌中，一些细胞基因的AS发生了改变，且EBNA1的表达与这些变化相关。因此，本研究的主要目标是系统性地探究EBNA1蛋白是否能以及如何调节宿主细胞基因，特别是与癌症相关基因的AS，并揭示其潜在的分子机制，从而为理解EBV的致癌机制提供新的视角。
详细的研究流程包含以下六个主要步骤：1. 构建并验证稳定表达EBNA1的细胞模型；2. 使用高通量RT-PCR平台大规模筛查EBNA1对AS的影响；3. 对筛查结果进行生物信息学分析；4. 探究EBNA1影响AS的潜在机制之一——对剪接因子表达的调控；5. 探究EBNA1影响AS的潜在机制之二——与细胞mRNA的直接结合；6. 验证RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）结果。
第一步：稳定细胞系的建立与验证。 研究以HEK293T细胞为模型，因其在EBNA1功能研究中被广泛使用。通过转染携带FLAG-HA双标签的EBNA1表达质粒（MSCV-N EBNA1，由Karl Munger馈赠），并经嘌呤霉素筛选，建立了稳定表达EBNA1-FLAG-HA蛋白的细胞系（HEK293T-EBNA1）。通过蛋白质印迹（Western Blot）使用抗HA、抗FLAG以及特异性抗EBNA1的抗体进行检测，证实了约80 kDa大小的EBNA1蛋白成功表达。免疫荧光实验进一步确认了EBNA1蛋白定位于细胞核内，这与已知其生物学功能相符。对照组为未转染的原始HEK293T细胞以及转染空载MSCV-N载体的HEK293T细胞。
第二步：高通量RT-PCR筛查AS事件。 这是本研究的核心筛查步骤。研究人员从对照组和HEK293T-EBNA1细胞中提取高质量的总RNA。随后，使用一个专门设计的高通量RT-PCR平台进行分析，该平台包含1449对针对1238个与癌症相关基因的特定AS事件（Alternative Splicing Events, ASE）设计的引物。每个ASE的引物设计能够通过毛细管电泳区分其长、短异构体（即不同剪接形式）产生的不同长度扩增产物。通过计算“剪接百分比”（Percent-Spliced-In, PSI）这一指标，来量化每个ASE在两种条件下的状态变化。设定阈值ΔPSI绝对值大于等于10的ASE被认为受到EBNA1表达的显著影响。所有筛选出的潜在阳性结果均经过研究人员手动检查电泳图进行二次确认，以确保峰值判读的准确性。
第三步：生物信息学分析。 对第二步鉴定出的、受EBNA1调控的基因进行功能富集分析。使用PANTHER数据库分析这些基因编码蛋白的类别分布。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，以寻找这些基因之间可能存在的功能联系。通过DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology, GO）分析和KEGG通路富集分析，以探索这些基因在生物学过程、分子功能和细胞组分以及信号通路层面的共性。
第四步：探究机制——EBNA1对剪接因子蛋白水平的影响。 为了探究EBNA1可能通过改变细胞剪接因子表达水平来间接影响AS的机制，研究团队通过蛋白质印迹法检测了多种剪接因子在EBNA1表达前后的蛋白丰度变化。检测的剪接因子涵盖了不同的家族，包括hnRNP家族（hnRNPA1, hnRNPH1）、SR家族（SRSF2, p-SRSF2, SRSF3, SRSF6, SRSF9, SRSF10）以及其他通用剪接因子（ESRP1, FOX-2, RBM23, SF1）。同时，为了区分转录水平和转录后水平的调控，还使用qRT-PCR检测了相关剪接因子的mRNA表达水平。
第五步：探究机制——EBNA1与细胞RNA的直接结合。 鉴于EBNA1已被报道具有RNA结合能力，本研究采用RNA免疫共沉淀结合高通量测序（RIP-seq）技术来系统性鉴定EBNA1在细胞内直接结合的RNA分子。实验使用抗HA的琼脂糖珠分别对HEK293T-EBNA1和对照HEK293T细胞的裂解液进行免疫沉淀，富集与EBNA1蛋白结合的RNA。为确保实验质量，进行了严格的控制：通过蛋白质印迹验证免疫沉淀效率；通过Agilent Bioanalyzer检测输入RNA的完整性（RIN值>8.9），确保实验过程未导致RNA严重降解；对免疫沉淀获得的RNA使用Illumina Ribo-Zero试剂盒去除核糖体RNA（rRNA）以富集mRNA和其他非编码RNA。随后构建文库，在Illumina HiSeq 4000平台上进行100 bp双端测序。
第六步：RIP-seq数据分析和验证。 对测序获得的原始数据（约2200万条高质量读长）进行生物信息学分析。流程包括：使用Trimmomatic去除接头和低质量序列；使用STAR软件将读长比对到人类参考基因组（hg38）；使用SAMtools去除PCR和测序重复；最后使用专门为RIP-seq设计的R软件包RIPseeker进行“峰”（peak）的识别，即EBNA1显著富集的RNA基因组区域。为了确保结果的严谨性，采用了多重统计学过滤标准：Benjamini校正后p值<0.05，错误发现率（FDR）<0.1，EBNA1样本中的读长计数高于对照样本，且富集倍数>1.5。通过人工检查读长覆盖度对自动识别的峰进行最终确认和去伪存真。对鉴定出的EBNA1潜在结合靶点，通过常规RIP实验结合qRT-PCR（RIP-qPCR）进行了生物学重复验证。此外，研究人员还特别检查了RIP-seq数据中EBNA1是否结合了其自身的mRNA，并设计了针对EBNA1编码区不同位置的引物进行RIP-qPCR验证。最后，为了验证EBNA1是否通过与特定mRNA的直接结合来调控其AS，研究人员从RIP-seq鉴定出的结合区域中，挑选了可能涉及AS事件的区域（如覆盖特定外子或内含子），设计了AS特异性引物进行RT-PCR，比较其在对照组和EBNA1表达组中的剪接模式是否改变。
本研究的主要结果如下：
在高通量RT-PCR筛选中，共鉴定出89个基因的AS模式因EBNA1的表达而发生显著改变（ΔPSI绝对值≥10）。这些基因功能多样，涉及水解酶、核酸结合蛋白、转运蛋白、转录因子、信号分子等多种类别。代表性例子包括：核受体共激活因子CCDC62和膜信号蛋白LPPR5的特定ASE从长异构体向短异构体转变；而参与MAPK信号通路的酪氨酸受体激酶NTRK2则从短异构体向长异构体转变。生物信息学分析（第三步）显示，这些受影响的基因并未高度集中于单一的蛋白类别。STRING蛋白互作网络分析发现了一个小但显著的相互作用网络（p=0.03），其中包含RUNX2、PAX2、SYK、BMP4和ITGB1等与转录调控、形态发生和细胞分化相关的蛋白。KEGG通路富集分析显示，除了预期的癌症相关通路（如PI3K-Akt通路）外，与细胞粘附相关的通路（如粘着斑、ECM-受体相互作用、细胞粘附分子）显著富集，提示EBNA1可能优先影响粘附相关基因的AS。
在机制探究方面，蛋白质印迹结果（第四步）显示，EBNA1的表达显著降低了四种剪接因子的蛋白水平：hnRNPA1、FOX-2、RBM23和SF1（下降幅度为1.5至4倍）。而其他检测的剪接因子（如hnRNPH1、SRSF3等）的蛋白水平则没有明显变化。重要的是，qRT-PCR结果显示这四种剪接因子的mRNA水平并未发生统计学上的显著变化，这表明EBNA1是在蛋白质翻译或稳定性层面影响了这些剪接因子的丰度，而非通过转录调控。
RIP-seq及其验证结果（第五、六步）提供了EBNA1与细胞RNA直接作用的证据。经过严格的生物信息学筛选和人工 curation，最终确定了51个EBNA1高置信度结合的RNA区域，对应52个独特的注释基因（其中一个是重叠区域）。这些结合靶点绝大多数（94%）是蛋白质编码基因，其余为假基因和非编码RNA。基因本体分析显示，EBNA1结合的RNA显著富集于核糖体生物合成、翻译、染色质组织等生物学过程，其编码蛋白在细胞组分上富集于核糖体和核小体，分子功能上富集于核糖体结构成分和poly(A) RNA结合。通过独立的RIP-qPCR实验，成功验证了四个靶点（HIST1H2BJ, HIST1H4H, RPL10A, RPS3AP6）在EBNA1免疫沉淀物中显著富集。然而，一个关键的发现是：这51个EBNA1结合的RNA靶点，没有任何一个出现在之前高通量筛查鉴定出的89个AS受调控的基因列表中。此外，针对RIP-seq峰所在位置可能存在的AS事件进行的RT-PCR分析也显示，EBNA1的表达并未改变这些潜在结合区域的剪接模式。
研究的核心结论是：EBNA1蛋白能够广泛地调节宿主细胞中与癌症相关基因的选择性剪接谱。这种调节作用并不依赖于EBNA1自身与这些靶标mRNA的直接结合活性（机制三），而是更可能通过两种间接机制实现：一是与剪接因子（如已知的hnRNPH1）发生蛋白质-蛋白质相互作用，从而影响剪接因子的功能或定位；二是调控特定剪接因子（如hnRNPA1， FOX-2， RBM23， SF1）在蛋白质水平的表达，从而改变细胞内促进和抑制剪接的因子之间的平衡，最终导致广泛的AS重编程。此外，研究首次在细胞环境下通过RIP-seq证实EBNA1能够与特定的细胞mRNA（主要是组蛋白和核糖体蛋白编码基因）结合，但这一结合功能与其AS调控功能似乎是分离的。
本研究的科学价值与意义在于：它首次系统性地揭示了EBV核心潜伏蛋白EBNA1作为宿主细胞剪接调节器的新功能，将EBV的致癌蛋白与宿主细胞转录后调控的关键环节——选择性剪接联系起来。这为理解EBV如何在潜伏感染期间重塑宿主细胞蛋白质组，进而促进细胞转化和肿瘤发生提供了全新的分子机制视角。研究不仅扩展了我们对EBNA1多功能性的认识，也深化了对疱疹病毒与宿主相互作用的复杂性的理解。从应用前景看，识别出病毒特异诱导的AS事件，可能为开发针对病毒相关疾病（如EBV相关癌症）的新型治疗策略（如靶向特定剪接事件的剪接转换寡核苷酸药物）提供了潜在的分子靶点。
本研究的亮点在于：1. 研究思路的系统性与创新性：首次针对单个EBV蛋白（EBNA1）进行了大规模的AS功能筛查，并将表型（AS改变）与机制（剪接因子表达、RNA结合）探索有机结合。2. 方法学的严谨与互补：结合了高通量RT-PCR筛查、RIP-seq、蛋白质印迹、qPCR验证等多种技术，从多个层面验证假设，结论扎实。3. 发现了机制分离现象：明确区分了EBNA1的RNA结合功能与其AS调控功能，指出后者主要通过间接途径实现，这是一个重要的新发现。4. 数据公开与可重复性：研究将高通量测序数据公开于NCBI GEO数据库（登录号GSE107808），遵循了良好的科研实践。其他有价值的内容包括研究中对实验细节和质量控制的详细描述（如RNA完整性检测、RIP-seq中rRNA去除的验证等），以及对EBNA1可能结合自身mRNA这一有趣假设的初步探索和后续分析，为后续研究提供了线索和方向。