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关于GSK3β与C3G之间复合物形成及相互调控机制的研究报告

第一， 研究团队与发表信息 本研究的主要作者包括 Divya Sriram, Kunal Dayma, Ambure Sharada Devi, Akhouri Kishore Raghawan, Shivali Rawat 以及通讯作者 Vegesna Radha。研究团队来自印度海得拉巴的 CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-细胞与分子生物学中心)。该研究成果发表于期刊《BBA - Molecular Cell Research》（第1868卷，2021年），并于2021年1月13日在线发表。

第二， 研究的学术背景与目标 本研究聚焦于细胞信号转导和发育生物学领域，旨在深入探讨糖原合酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β, GSK3β）与一种名为C3G（也称为Rapgef1）的蛋白质之间的相互作用及其功能意义。

• 背景知识：

  1. GSK3β的重要性： GSK3β是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞代谢、增殖和分化中扮演核心调节角色。其活性受到严密调控，异常与多种人类疾病相关，如神经退行性疾病、糖尿病和癌症。它的一个关键负调控机制是通过Akt激酶在其第9位丝氨酸（Ser9）处进行磷酸化，从而抑制其活性。
  2. C3G的重要性： C3G是Rap1鸟嘌呤核苷酸交换因子，对哺乳动物胚胎发育至关重要，并在细胞粘附、葡萄糖摄取、增殖和细胞命运决定等多种生理过程中发挥作用。研究表明，C3G水平影响β-连环蛋白（β-catenin）信号，并且是神经元和肌细胞分化所必需的。
  3. 未解之谜： 尽管GSK3β和C3g都参与关键的细胞分化过程（如肌细胞分化），且两者功能的失调均会导致早期胚胎致死，但它们之间是否存在直接的物理与功能联系尚不清楚。阐明这种相互作用有望揭示调控细胞分化和稳态的新机制。

• 研究目标： 本研究旨在探索并阐明GSK3β与C3g之间的相互作用关系。具体目标包括：1）验证两者是否存在直接的物理相互作用；2）确定C3g是否为GSK3β的底物；3）鉴定C3g中负责与GSK3β结合的域；4）探究GSK3β对C3g磷酸化及亚细胞定位的影响；5）评估C3g是否能反过来调控GSK3β的活性；6）研究这种双向调控在肌细胞分化中的功能重要性。

第三， 详细的研究流程与方法 研究采用了多种细胞生物学、生物化学和分子建模技术，流程严谨且系统。

• 流程一：验证GSK3β与C3g的体内外相互作用

  1. 研究材料： 使用C2C12小鼠成肌细胞、HEK293T人胚胎肾细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞等细胞系，以及小鼠脑组织作为高表达GSK3β的组织样本。
  2. 实验方法：
     • 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）： 分别从C2C12、HEK293T细胞裂解液以及小鼠脑组织裂解液中，使用C3g特异性抗体进行免疫沉淀，然后通过Western Blot检测沉淀物中是否存在GSK3β和Akt，并检测其磷酸化状态（如pS9-GSK3β， pS473-Akt）。使用对照IgG进行平行实验。
     • 体外Pull-down实验： 将重组表达的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）或GST-GSK3β融合蛋白固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后与HEK293T或MDA-MB-231的细胞裂解液共孵育，检测是否能“拉下”内源性的C3g和Akt。
     • 结构域相互作用分析： 构建了C3g的不同缺失突变体（如缺失N端的δN-C3g， 缺失C端的δC-C3g，以及独立的Crk结合区GFP-CBR）。通过Co-IP（使用GFP-Trap珠子）或体外Pull-down（使用重组GST-CBR蛋白）等方法，研究这些截短体与GSK3β的结合能力，以确定C3g中关键的相互作用域。

• 流程二：鉴定C3g中的GSK3β相互作用域

  1. 生物信息学分析与分子建模：
     • 通过序列比对，在C3g的C端（氨基酸776-793）发现了一个与已知的GSK3β相互作用域（GID， 存在于Axin、Gskip等蛋白中）相似的序列。该序列部分重叠于先前鉴定的C3g核输出信号（NES）。
     • 使用多种二级结构预测工具和分子动力学模拟（使用GROMACS软件和AMBER力场），以已知的GSK3β-Axin GID复合物结构（PDB ID： 1O9U）为模板，对C3g该区域与GSK3β的结合模式进行建模。
  2. 突变体验证：
     • 构建了包含该C3g-NES序列的Rev-C3g-NES-GFP融合蛋白，通过Co-IP验证其与GSK3β的相互作用。
     • 针对GID关键残基，构建了点突变体L789P（模拟Axin GID中的失活突变）和L779/781A（破坏NES的双亮氨酸突变）。通过Co-IP比较这些突变体与野生型（WT）C3g与GSK3β的结合能力，并结合分子模型分析突变对螺旋结构稳定性的影响。

• 流程三：验证C3g是GSK3β的底物

  1. 磷酸化诱导的迁移率变化： 在MDA-MB-231细胞中过表达Flag-C3g或GFP-CBR，并用GSK3β抑制剂氯化锂（LiCl）或磷酸酶抑制剂冈田酸（Okadaic Acid， OA）处理。通过Western Blot观察蛋白质条带的迁移变化，间接判断其磷酸化状态。
  2. 体外激酶实验： 从HEK293T细胞中免疫沉淀出过表达的C3g-GFP，与纯化的重组GSK3β酶在含有[γ-³²P]ATP的激酶缓冲液中孵育。通过放射自显影检测C3g是否被直接磷酸化。实验中加入了LiCl或另一种GSK3β抑制剂CHIR99021作为阴性对照。
  3. 磷酸化位点鉴定与突变分析：
     • 利用生物信息学工具（PhosphositeFinder， NetPhos）和已有的质谱数据，预测并筛选出C3g中潜在的GSK3β磷酸化位点，重点关注了三个高度保守的区域：S8（N端）， S293/296（位于CBR）， 和S345/349/352（位于CBR）。
     • 通过定点突变，分别构建了这些位点的单点突变体（S8A， S293/296A， S345/349/352A）以及将这些位点全部突变的“三重突变体”。
     • 使用体外激酶实验，比较这些突变体与野生型C3g被GSK3β磷酸化的效率。
     • 进一步，使用了两种GSK3β的突变体酶：R96A（无法磷酸化“引发型”底物）和L128A（无法磷酸化“非引发型”底物），来测试C3g磷酸化对“引发”的依赖性。

• 流程四：探究GSK3β磷酸化对C3g功能的影响

  1. 亚细胞定位研究：
     • 细胞分馏： 将表达野生型C3g或三重突变体（TM）的细胞进行核质分离，通过Western Blot定量比较两者在核与质中的分布比例。
     • 免疫荧光与共转染： 在C2C12细胞中共转染C3g-GFP与不同形式的HA-GSK3β（野生型WT， 组成型活性突变体CA， 激酶失活突变体KD）。通过荧光显微镜观察并统计C3g发生核转位的细胞比例。
  2. 蛋白质稳定性检测： 用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（Cycloheximide， CHX）处理表达野生型C3g或TM的细胞，在不同时间点收集样品，通过Western Blot检测C3g蛋白的降解速率，评估GSK3β磷酸化是否影响其稳定性。

• 流程五：探究C3g对GSK3β活性的反向调控

  1. 过表达与敲低实验：
     • 在C2C12、MDA-MB-231和Neuro2a细胞中过表达C3g，通过Western Blot检测pS9-GSK3β（失活形式）、pS473-Akt和pT308-Akt（活性形式）的水平变化。
     • 利用CRISPR/Cas9技术在C2C12细胞中构建了C3g敲除（KO）的稳定克隆。比较野生型与KO细胞中上述磷酸化蛋白以及肌源性转录因子MyoD的表达水平。
  2. 信号通路抑制实验： 在过表达C3g的MDA-MB-231细胞中，分别使用PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂IV进行处理，观察这些抑制剂对C3g诱导的GSK3β S9位点磷酸化的影响。
  3. 相关性分析： 比较了C3g表达水平不同的几种结肠癌细胞系（SW620， SW480， Colo-205）与乳腺癌细胞MDA-MB-231中pS9-GSK3β的水平。

• 流程六：功能验证——在肌细胞分化中的核心作用

  1. 肌管形成实验：
     • 在C2C12细胞中单独或共转染C3g与野生型/组成型活性GSK3β，或将C3g三重突变体转染入细胞。诱导分化后，通过免疫荧光染色，定量分析表达细胞中肌管（含3个或以上细胞核）形成的百分比和平均长度。
     • 同时，通过Western Blot检测在这些条件下Akt和GSK3β的磷酸化水平。
  2. 亨廷顿蛋白聚集实验： 使用一个可诱导表达突变型亨廷顿蛋白（带有97个谷氨酰胺重复，Htt97Q-GFP）的稳定细胞系。在该细胞系中过表达C3g并诱导突变蛋白表达，通过荧光显微镜统计C3g阳性细胞与阴性细胞中蛋白聚集体的形成比例。已知GSK3β抑制会促进突变亨廷顿蛋白的聚集。

第四， 详细的研究结果 研究取得了一系列层次分明、相互印证的重要发现。

• 结果一：证实了GSK3β与C3g在体内外形成复合物。 免疫共沉淀实验表明，内源性及过表达的C3g能够与GSK3β以及Akt共同沉淀。从小鼠脑组织中也成功共沉淀出三者及其磷酸化形式。体外Pull-down实验进一步证明重组GSK3β能直接结合细胞裂解液中的C3g。结构域分析揭示，C3g的C端催化结构域并非结合所必需，但有助于稳定相互作用；独立的CBR域在体外能与GSK3β结合，但在细胞内环境下不能形成稳定复合物，暗示体内结合需要C端区域的参与。

• 结果二：在C3g的C端鉴定出一个关键的GSK3β相互作用域（GID），该域与其核输出信号（NES）重叠。 序列比对和分子建模显示，C3g的776-793位氨基酸能够形成α螺旋，与GSK3β的螺旋-环结合口袋相互作用。实验证明，包含此序列的Rev-C3g-NES-GFP能有效结合GSK3β。点突变分析发现，破坏NES的双亮氨酸突变（L779/781A）显著削弱了与GSK3β的结合，而模拟Axin的经典失活突变（L789P）则无影响。分子动力学模拟支持这一发现，显示L779/781A突变破坏了螺旋结构的稳定性，从而减少了与GSK3β的相互作用力。

• 结果三：C3g是GSK3β的直接底物，可在多个位点被磷酸化。 药物处理实验显示，抑制GSK3β会减少C3g的慢迁移条带，而抑制磷酸酶则增加该条带，提示C3g的磷酸化状态受GSK3β调节。体外激酶实验直接证明纯化的GSK3β能够磷酸化免疫沉淀的C3g，且该磷酸化可被GSK3β抑制剂阻断。通过对预测位点的突变分析，发现S8、S293/296和S345/349/352是GSK3β的重要磷酸化位点，将这些位点全部突变的三重突变体（TM）其磷酸化水平降低了80%以上。使用R96A和L128A GSK3β突变酶的实验表明，GSK3β既能磷酸化C3g的“引发型”位点，也能磷酸化“非引发型”位点。

• 结果四：GSK3β介导的磷酸化调控C3g的亚细胞定位。 细胞分馏实验显示，磷酸化缺陷的三重突变体（TM）在核内的比例显著高于野生型C3g。共转染实验发现，过表达激酶失活的GSK3β（KD）能促进C3g的核定位，而过表达组成型活性的GSK3β（CA）则无此效应。这证实了GSK3β的激酶活性是将C3g滞留在胞质中所必需的。此外，GSK3β磷酸化并不显著影响C3g的蛋白质稳定性。

• 结果五：C3g能反向调控GSK3β的活性，这依赖于PI3K/Akt信号通路。 过表达C3g显著增加了多种细胞中Akt（S473和T308位点）和GSK3β（S9位点）的磷酸化水平，表明C3g能激活Akt并抑制GSK3β。相反，在C3g敲除的C2C12细胞中，Akt和GSK3β S9的磷酸化水平以及肌源性因子MyoD的表达均显著降低。使用PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂IV处理，可以阻断C3g诱导的GSK3β S9磷酸化。此外，在C3g表达水平较低的结肠癌细胞中，pS9-GSK3β的水平也相应较低。这些结果共同表明，C3g通过激活PI3K/Akt信号通路来促进GSK3β的S9位点磷酸化，从而实现对GSK3β活性的负调控。

• 结果六：C3g诱导的肌细胞分化依赖于其抑制GSK3β活性的能力。 功能实验表明，共表达组成型活性的GSK3β（CA）会显著抑制C3g促进的肌管形成。更重要的是，磷酸化缺陷的C3g三重突变体（TM）不仅失去了诱导肌管形成的能力，也失去了激活Akt和抑制GSK3β（增加其S9磷酸化）的能力。这直接证明了C3g的促分化功能与其调控GSK3β活性的能力紧密偶联。作为GSK3β活性被抑制的一个功能性读数，过表达C3g也如预期般增强了依赖于GSK3β抑制的突变亨廷顿蛋白聚集体的形成。

第五， 研究的结论与意义 本研究的主要结论是：GSK3β与C3g之间存在着一种新颖的、双向的物理与功能相互作用。 C3g不仅是GSK3β的相互作用伙伴和底物，其磷酸化状态受GSK3β调控进而影响其核质定位；同时，C3g还能通过激活PI3K/Akt信号通路，反过来促进GSK3β的抑制性磷酸化（S9），从而负调控GSK3β的活性。这种相互调控机制对于C3g发挥其诱导肌细胞分化的功能至关重要。

• 科学价值：

  1. 揭示了新的调控节点： 本研究在GSK3β和C3g这两个重要的信号分子之间建立了直接联系，为理解细胞分化、存活和代谢的复杂调控网络增加了一个新的关键环节。
  2. 阐明了新的调控机制： 发现了C3g作为GSK3β负调控因子的新功能，并揭示了这种调控是通过经典的PI3K/Akt通路介导的。同时，鉴定出C3g中一个兼具NES和GID功能的重叠域，为蛋白质功能域的多样性和复杂性提供了新案例。
  3. 连接了发育与疾病： 由于GSK3β和C3g的失调都与发育缺陷和多种疾病相关，阐明它们的相互作用机制为理解相关病理过程（如肌肉发育异常、神经退行性疾病、癌症）提供了新的分子基础。

• 应用潜力： 针对GSK3β-C3g相互作用界面的干预，可能成为治疗相关疾病（如通过促进肌生成治疗肌肉萎缩性疾病，或通过调节GSK3β活性治疗神经退行性疾病）的新策略。此外，C3g作为GSK3β活性的一个细胞内在调节器，其表达水平或活性状态可能成为预测疾病进展或治疗响应的潜在生物标志物。

第六， 研究的亮点 1. 重要的发现： 首次系统性地证明并阐明了GSK3β与C3g之间复杂的双向调控关系，特别是发现了C3g作为GSK3β新型负调控因子的功能，并明确了该功能在其促进肌细胞分化中的核心地位。 2. 研究方法的综合性： 研究采用了多层次、多角度的实验策略，从体内外的生物化学互作验证，到精细的分子建模与点突变分析，再到细胞定位、信号通路和最终的功能学表型验证，逻辑链条完整，证据坚实。 3. 创新性与特殊性： 在C3g中鉴定出一个独特的、重叠了核输出信号（NES）和GSK3β相互作用域（GID）的功能区域，并发现其关键残基（L779）不同于已知的GID保守残基，这拓展了对蛋白质相互作用域的理解。研究将激酶-底物关系与复杂的反馈调控网络相结合，揭示了信号传导中一种精巧的相互制约模式。

第七， 其他有价值的补充 本研究的讨论部分还提出了一些富有洞见的观点和未来方向：例如，C3g与GSK3β的结合可能竞争性地干扰GSK3β与Axin的结合，从而将GSK3β的活性导向Wnt信号通路以外的其他底物；C3g可能通过与14-3-3蛋白结合来实现磷酸化依赖的胞质滞留；GSK3β对C3g的磷酸化可能调节C3g与其他CBR结合蛋白的互作，从而影响其作为支架蛋白的功能。这些猜想为后续研究提供了清晰的路线图。此外，研究也指出了在不同细胞类型或生理背景下，C3g对GSK3β和β-catenin的调控可能存在差异，提示了该调控网络的语境依赖性，值得进一步探索。