本研究报告涉及一项原创性科学研究，因此将按照类型a的要求进行撰写。

一、 作者、机构与发表信息

本研究的主要作者为Jens M. Chemnitz, Richard V. Parry, Kim E. Nichols, Carl H. June和James L. Riley。通讯作者是James L. Riley。研究团队主要来自宾夕法尼亚大学医学院艾布拉姆森家族癌症研究所和病理学与实验医学系（University of Pennsylvania School of Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute and Department of Pathology and Laboratory Medicine），以及费城儿童医院肿瘤科（Children’s Hospital of Philadelphia, Oncology）。这项研究于2004年发表在《免疫学杂志》（The Journal of Immunology）上，具体的卷期页码为第173卷，第2期，第945至954页。

二、 研究背景与目的

本研究属于免疫学领域，具体聚焦于T细胞免疫应答的负向调控机制。T细胞的活化和扩增是获得性免疫应答的核心，但必须受到严格的调控以防止过度活化导致自身免疫病。程序性死亡受体1（Programmed Death 1，PD-1）是CD28受体家族的一员，与CTLA-4类似，被认为在维持外周耐受中扮演着重要的负向调控角色。PD-1缺陷小鼠会发展出多种自身免疫性疾病，这支持了其作为免疫“刹车”的观点。然而，关于PD-1如何在其天然配体（PD-L1/L2）结合后，在分子层面抑制原发性（非转化）T细胞活化的具体机制，在当时尚不明确。

PD-1的胞质尾区含有两个酪氨酸基序：一个近膜的免疫受体酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM）和一个远膜的免疫受体酪氨酸转换基序（Immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM）。先前在Jurkat T细胞系或B细胞肿瘤系中的研究表明，PD-1的抑制作用依赖于ITSM，并且该基序在受体结合后能招募含有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶2（Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2, SHP-2）。但肿瘤细胞系通常存在关键信号分子（如SHIP）的缺陷，可能无法完全反映原发性T细胞中PD-1信号转导的真实情况。

因此，本研究旨在使用原代人类CD4+ T细胞这一更接近生理状态的研究模型，阐明PD-1信号传导的关键分子机制。具体目标包括：1）验证PD-1在原发性T细胞中是否发挥抑制功能；2）确定PD-1胞质尾区中哪个酪氨酸基序（ITIM或ITSM）对其抑制功能至关重要；3）鉴定在原代T细胞中与PD-1胞质尾区结合的“反式作用因子”（信号分子）；4）探究PD-1受体交联（ligation）是否是其发挥抑制功能的必要条件。最终，研究者希望揭示PD-1在生理条件下抑制T细胞活化的精确分子途径。

三、 详细研究流程

本研究设计严谨，流程环环相扣，主要包含以下关键步骤：

1. 建立研究模型与功能验证： * 研究对象与样本： 研究使用从健康供者分离的原代人类CD4+ T细胞。所有实验均在经伦理审查批准的协议下进行。 * 人工抗原呈递细胞（Artificial APC, aAPC）系统： 研究者开发并使用了aAPC系统。这是一种将特定抗体包被在磁珠上形成的“人工”刺激平台。通过组合不同的抗体，可以精确控制T细胞接收的信号。例如，用抗CD3和抗CD28抗体包被的磁珠（CD3/28）提供活化信号；在此基础上加入抗PD-1抗体（CD3/28/PD-1），则可以模拟PD-1被其配体交联的状态；使用抗MHC I类抗体作为对照（CD3/28/MHC I），该抗体能结合T细胞但不传递活化或抑制信号。 * 功能实验： 研究者首先用aAPC系统刺激原代CD4+ T细胞，通过实时定量PCR（RT-PCR）检测细胞因子（IL-2, IL-10, IL-13, IFN-γ）和存活因子Bcl-xL的mRNA表达水平，并通过细胞计数和CFSE染料稀释实验来评估T细胞增殖情况。结果明确显示，与对照相比，PD-1的交联能显著抑制由亚优化CD28共刺激所诱导的细胞因子产生和细胞增殖，证实了PD-1在原代T细胞中的抑制功能。

2. 构建嵌合受体并进行结构-功能分析： * 研究工具开发： 为了专门研究PD-1的胞内信号部分，并避免内源性PD-1的干扰，研究者构建了一个创新的嵌合受体。该受体将小鼠CD28（mCD28）的胞外区和跨膜区，与人类PD-1（hPD-1）的胞质尾区融合在一起（mCD28/hPD-1）。这样，可以使用针对mCD28的特异性抗体来选择性交联这个嵌合受体，从而“专一性”地研究PD-1胞质尾区的功能。 * 验证模型有效性： 通过慢病毒转导技术，将该嵌合受体高效导入原代CD4+ T细胞。功能实验表明，用抗mCD28抗体交联此嵌合受体，能重现内源性PD-1被交联时的抑制效果，即抑制细胞增殖和细胞因子表达，从而证明该嵌合受体模型是研究PD-1信号的有效工具。 * 定点突变研究： 研究者在嵌合受体的PD-1胞质尾区引入了单点突变：Y223F（破坏ITIM）和Y248F（破坏ITSM），以及双突变Y223F/Y248F。将这些突变体分别导入T细胞后，再用aAPC系统进行功能测试。结果发现，ITIM突变对PD-1的抑制功能几乎没有影响；而ITSM突变则完全废除了PD-1抑制IL-2产生和细胞增殖的能力。这明确表明，在原代人类CD4+ T细胞中，PD-1的抑制功能主要依赖于其ITSM基序，而非ITIM基序。

3. 鉴定与PD-1胞质尾区结合的信号分子（生化分析）： * 免疫共沉淀与蛋白质印迹（Co-IP & Western Blot）： 这是本研究的核心生化分析手段。研究者用表达野生型或突变型嵌合受体的T细胞，在不同条件下刺激（如使用过钒酸盐pervanadate进行最大程度酪氨酸磷酸化，或使用不同组合的aAPC进行更生理性的刺激），然后裂解细胞，用抗mCD28抗体进行免疫沉淀，富集嵌合受体及其结合蛋白复合物。 * 分子鉴定： 通过蛋白质印迹，首先使用抗磷酸化酪氨酸抗体（4G10）检测沉淀物中的磷酸化蛋白。结果发现，在过钒酸盐刺激下，野生型嵌合受体主要与一个约70 kDa的磷酸化蛋白复合物结合，而该复合物的形成严格依赖于完整的ITSM基序（Y248F突变使其消失）。这个70 kDa复合物的存在与PD-1的抑制功能完美相关，提示其是介导PD-1信号的关键因子。 * 具体蛋白鉴定： 进一步用特异性抗体检测发现，这个70 kDa复合物中同时包含SHP-2和SHP-1。这与之前仅在B细胞或Jurkat细胞中只发现SHP-2的结果不同，提示在原代T细胞中PD-1的抑制信号可能由这两种磷酸酶共同或协同介导。

4. 探究PD-1抑制功能的触发条件： * 关键发现实验： 研究者进行了一个关键的实验：他们用仅提供TCR刺激（CD3/MHC I）或仅提供嵌合受体交联（mCD28）的aAPC分别刺激细胞，然后检测SHP-2的招募情况。令人惊讶的是，仅TCR刺激（不交联PD-1）或仅交联mCD28（不提供TCR刺激），都能导致SHP-2被招募到PD-1的胞质尾区。当TCR刺激和mCD28交联同时存在时，SHP-2的招募有叠加效应。 * 功能与生化结果的矛盾与解释： 这个发现产生了一个重要矛盾：既然不交联PD-1（仅TCR刺激）也能招募SHP-2，那为什么只有同时交联PD-1才能抑制T细胞活化？这表明，SHP-2被招募到PD-1胞质尾区，是其发挥抑制功能的必要条件，但并非充分条件。PD-1受体本身的交联是一个额外的、必不可少的步骤。

5. 探索PD-1 ITSM与CD150 ITSM的差异： * 背景对比： ITSM最初在受体CD150中被定义，其特点是能根据适配蛋白SH2D1A的存在与否，“转换”所招募的下游分子：有SH2D1A时招募SHIP，没有时招募SHP-2。 * 相互作用验证： 为了探究PD-1的ITSM是否具有类似的“转换”功能，研究者在293T细胞中进行了共转染和免疫沉淀实验。结果表明，PD-1的胞质尾区不能与SH2D1A结合，无论其ITSM是否被磷酸化。因此，PD-1的ITSM无法像CD150那样招募SHIP。这定义了ITSM的一个新亚型：不与SH2D1A结合的ITSM。

四、 主要研究结果

1. 功能确认结果： 使用aAPC系统，在原代人类CD4+ T细胞中证实，抗体介导的PD-1交联能有效抑制由亚优化CD3/CD28共刺激诱导的细胞因子（IL-2, IL-10, IL-13, IFN-γ）表达、存活因子Bcl-xL上调以及T细胞增殖，确立了PD-1明确的抑制性功能模型。

2. 结构-功能关系结果： 通过嵌合受体和定点突变技术，获得明确证据：PD-1胞质尾区中，ITSM基序（Y248）对其抑制功能至关重要，而ITIM基序（Y223）的贡献微乎其微。这从“顺式作用元件”层面锁定了PD-1信号传导的关键位点。

3. 信号分子鉴定结果： 生化分析揭示，在原代人类CD4+ T细胞中，PD-1的ITSM在受体交联后，同时招募SHP-1和SHP-2，形成一个约70 kDa的磷酸化蛋白复合物。这一发现修正了此前基于转化细胞系的研究结论（只发现SHP-2），提示PD-1在生理条件下可能通过招募这两种磷酸酶来行使功能。

4. 抑制机制的关键发现结果： 本研究最核心的发现之一是揭示了PD-1抑制功能的“双重需求”：① 信号分子招募：T细胞活化（通过TCR或CD28信号）本身就能诱导SHP-2（可能还有SHP-1）与未交联的PD-1结合。② 受体空间定位：然而，仅此不足以抑制T细胞；必须同时发生PD-1受体交联。这表明，PD-1必须通过与配体（或实验中的抗体）结合，被“拉”到与TCR/CD28信号复合物足够近的空间位置（共定位），其携带的磷酸酶才能有效去磷酸化并关闭下游的活化信号通路。这解释了为什么PD-1的配体必须与抗原呈递在同一个细胞上（顺式作用）才能有效抑制。

5. ITSM特性分析结果： 证明了PD-1的ITSM与原型CD150的ITSM功能不同。PD-1的ITSM不能结合适配蛋白SH2D1A，因此也无法招募SHIP。这表明PD-1的抑制信号通路相对专一，不涉及SH2D1A依赖的信号“转换”。

五、 结论与研究价值

本研究得出以下重要结论：在原代人类CD4+ T细胞中，PD-1通过其胞质尾区的ITSM基序，在受体被配体交联后，招募SHP-1和SHP-2磷酸酶。PD-1发挥抑制功能不仅需要招募这些磷酸酶，更需要受体交联事件本身，这可能通过促使PD-1与TCR/CD28信号复合物发生空间共定位来实现。此外，PD-1的ITSM不具有CD150那样的SH2D1A依赖性信号转换能力。

科学价值： 1. 模型先进性： 首次系统地在原代人类CD4+ T细胞（而非转化细胞系）中研究了PD-1的信号机制，结果更贴近生理状态。 2. 机制深化： 明确了ITSM的核心地位，并首次在原代T细胞中报道了SHP-1的招募，完善了PD-1下游信号分子的图谱。 3. 提出新范式： 提出了PD-1抑制的“空间共定位”假说，即抑制不仅需要下游效应分子，还需要受体在膜上的正确拓扑定位。这一概念对理解免疫突触中抑制性受体的作用方式具有重要启发意义。 4. 区分ITSM亚型： 明确了PD-1的ITSM是一种不与SH2D1A结合的新亚型，加深了对ITSM家族功能多样性的认识。

应用价值： 该研究为以PD-1/PD-L1通路为靶点的肿瘤免疫治疗（如PD-1/PD-L1抑制剂）提供了坚实的分子机制基础。理解PD-1如何精确地关闭T细胞应答，有助于优化现有疗法、预测疗效、以及开发克服耐药性的新策略。

六、 研究亮点

1. 研究对象的生理相关性高： 坚持使用原代人类CD4+ T细胞作为研究模型，确保了研究结论对于理解人体内免疫调控具有更高的可靠性和外推价值。
2. 技术方法创新与融合： 成功构建并验证了mCD28/hPD-1嵌合受体模型，结合高效的慢病毒转导技术和定制的aAPC刺激系统，实现了对PD-1胞内信号的原位、特异性和可操控性研究。
3. 发现PD-1抑制的“必要非充分条件”： 率先揭示了“SHP-2招募”与“受体交联”在PD-1抑制功能中的分离现象，从而提出了“空间共定位”这一关键机制，这是本研究的核心理论贡献。
4. 修正并丰富了PD-1信号图谱： 在原代T细胞中同时鉴定出SHP-1和SHP-2作为PD-1的效应分子，修正了前人基于细胞系的研究结果，提供了更完整的信号网络视图。

七、 其他有价值的内容

研究中还观察到一些有趣的现象：PD-1的mRNA在T细胞活化后迅速上调，但其细胞表面蛋白的表达却延迟至24小时后才显著增加，表明存在转录后调控。此外，即便PD-1表面表达水平极低，也能产生强烈的抑制效果，提示PD-1信号具有极高的效率或放大效应。这些细节为进一步研究PD-1表达的调控及其功能阈值提供了线索。

这项发表于2004年的研究是PD-1信号传导领域的一座里程碑。它采用生理相关模型，通过精巧的实验设计，不仅阐明了PD-1抑制功能的关键分子基础，更提出了影响深远的“空间共定位”机制，为后续十余年PD-1/PD-L1通路的基础与转化研究奠定了坚实的基础。