纳米孔技术实现20种蛋白质氨基酸及其修饰物的精准鉴别——基于工程化MspA纳米孔的单分子测序新策略

一、研究团队与发表信息
本研究由南京大学生命分析化学国家重点实验室Shuo Huang团队主导，Kefan Wang、Shanyu Zhang、Xiao Zhou等作为共同第一作者完成，于2023年8月21日发表于《Nature Methods》（DOI: 10.1038/s41592-023-02021-8）。合作单位包括南京大学化学与生物医学创新中心及物理系固态微结构国家重点实验室。

二、学术背景
蛋白质是生命活动的主要执行者，但其序列解析技术长期依赖Edman降解（Edman degradation）和质谱（mass spectrometry），存在低丰度蛋白检测灵敏度不足、翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）解析困难等问题。纳米孔（nanopore）单分子传感技术虽在核酸测序中表现突出，但蛋白质测序仍面临两大挑战：
1. 氨基酸分辨率不足：现有纳米孔（如α-溶血素α-HL）仅能区分部分氨基酸对，无法同时鉴别全部20种蛋白源性氨基酸（proteinogenic amino acids）；
2. PTMs识别缺位：修饰氨基酸的直接检测尚未实现。
本研究旨在通过工程化改造分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porin A, MspA），构建一种含单一镍离子（Ni²⁺）修饰的异源八聚体纳米孔（MspA-NTA-Ni），结合机器学习算法，实现全氨基酸及PTMs的高精度鉴别。

三、研究流程与方法
1. 纳米孔设计与构建
- 异源八聚体工程化：设计(N90C)₁(M2)₇突变体，其中1个亚基含半胱氨酸（Cys90）用于定点修饰，7个亚基不含游离巯基。通过凝胶电泳分离纯化目标八聚体。
- NTA-Ni²⁺修饰：利用马来酰亚胺-C3-氮川三乙酸（maleimido-C3-NTA）与Cys90特异性反应，引入单一NTA适配体，再螯合Ni²⁺形成MspA-NTA-Ni。单通道记录（single-channel recording）实时监测修饰过程，电流下降（~150 pA→115 pA）证实修饰成功（图1c）。

1. 氨基酸传感机制

   • 实验体系：1.5 M KCl缓冲液（pH 9.0），+100 mV跨膜电压。氨基酸与Ni²⁺形成三元复合物（NTA-Ni²⁺-AA），产生特征性电流信号（图1d）。
     
   • 信号特征：所有氨基酸均产生正向电流偏移（Iaa > I₀），且信号幅值（ΔI=38–100 pA）显著高于α-HL（2–5 pA）。组氨酸（histidine）和脯氨酸（proline）因特殊结构分别产生两种事件类型（H1/H2、P1/P2）。
     

2. 机器学习辅助识别

   • 特征矩阵构建：提取ΔI、噪声幅值（SD）、 dwell time（toff）、偏度（skewness）、峰度（kurtosis）5维特征，建立包含6,000个标记事件的数据库。
     
   • 模型训练：采用支持向量机（SVM）、决策树等7种分类器，10折交叉验证。5D矩阵的二次SVM模型准确率达98.8%，显著优于仅用ΔI/SD的2D矩阵（96.0%）。混淆矩阵显示所有氨基酸识别准确率≥95%（图3b）。
     

3. PTMs与复杂样本分析

   • 修饰氨基酸检测：成功区分甲基化（Nω,N’ω-dimethyl-arginine, me-R）、乙酰化（O-acetyl-threonine, ac-T）、糖基化（GlcNAc-N）和磷酸化（O-phosphoserine, p-S）修饰（图4）。
     
   • 实际应用验证：
     
     • 氨基酸片剂分析：直接检测商业复合氨基酸片剂，识别出9种成分（如精氨酸、亮氨酸），与产品说明一致（图5）。
       
     • 肽酶解产物测序：用亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase, LAP）消化三肽（GHK）和八肽（TLEIYNRF），纳米孔准确报告游离氨基酸组成（图6）。
       

四、主要结果与逻辑关联
1. 分辨率突破：MspA-NTA-Ni的锥形孔道结构将电流聚焦于收缩区，结合Ni²⁺的化学限制作用，实现20种氨基酸ΔI差异达62 pA（图2b）。
2. 电荷敏感性：ΔI与氨基酸净电荷（znet）负相关（图2c），解释了谷氨酸（Glu, znet=−1.28）与谷氨酰胺（Gln, znet=−0.66）等相似质量氨基酸的区分机制。
3. 分子动力学模拟：证实Ni²⁺结合后NTA适配体构象稳定，而氨基酸结合时因Ni²⁺配位变化导致孔道电导增加（图1d, 补充图19-20）。

五、研究结论与价值
1. 科学意义：首次实现单分子水平全氨基酸及PTMs的同步鉴别，为纳米孔蛋白质测序奠定基础。
2. 应用前景：
- 精准医学：无需标记即可检测低丰度修饰蛋白，助力癌症标志物发现。
- 工业质检：快速分析营养补充剂氨基酸成分，方法稳定性达3小时（补充图30）。

六、研究亮点
1. 创新纳米孔设计：单一Ni²⁺修饰的异源八聚体MspA，兼具高分辨率与稳定性。
2. 多维特征机器学习：5D特征矩阵将准确率提升至98.6%，优于传统2D散点图分析。
3. 实际样本验证：从合成肽到商业产品，证实技术鲁棒性。

七、其他价值
本研究开发的MspA-NTA-Ni可扩展至其他金属离子适配体（如Cu²⁺、Co²⁺），为小分子检测提供通用平台。代码与数据集已开源（Figshare DOI: 10.6084/m9.figshare.23995890）。