关于Nanog驱动结直肠癌干细胞上皮-间质转化与自我更新及其靶向干预恢复药物敏感性的研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由Kiarash Saleki、Sameerah Shaheen、Miao Xue、Amirreza Mazloomi、Sepideh Yousefi、Hossein Kashfi、Mehreen Ahmed、Roya Babaei-Jadidi、Bradley Spencer-Dene、Dominique Bonnet、Chris Denning以及通讯作者Abdolrahman S. Nateri*共同完成。研究团队主要来自英国诺丁汉大学医学院生物发现研究所的癌症遗传学与干细胞研究组，合作者还包括伊朗、沙特阿拉伯、美国等多国研究机构。该研究成果发表于期刊《Drug Resistance Updates》2026年第84卷，文章编号101321，于2025年11月4日在线发布。
二、 学术背景与研究目标
本研究聚焦于肿瘤生物学，特别是结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的耐药机制和癌症干细胞（Cancer Stem-like Cells, CSCs）领域。结直肠癌是全球范围内高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，其治疗失败的主要原因是化疗耐药和肿瘤复发。越来越多的证据表明，一小部分具有干细胞特性的癌细胞，即癌症干细胞样细胞（CRC-SCs），是驱动肿瘤生长、转移和耐药的核心。
上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是癌细胞获得迁移、侵袭和干细胞样特性的关键过程。同时，转录因子Nanog在胚胎干细胞（ESCs）的自我更新和多能性维持中起核心作用，其在多种癌症中的异常高表达与不良预后、转移和耐药密切相关。然而，Nanog在结直肠癌干细胞中调控EMT、自我更新和耐药的分子机制，特别是其与关键信号通路（如ERK和GSK-3β/β-catenin）的相互作用，尚不完全清楚。
本研究的目标是：深入探究Nanog在结直肠癌干细胞样细胞中对干性基因、对称分裂和耐药性的调控作用，重点关注其通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路调控EMT的机制，并评估靶向Nanog及其相关通路（使用小分子抑制剂U0126和TDZD-8）在克服结直肠癌耐药性方面的转化潜力。
三、 详细研究流程
本研究采用了多层次、多技术的综合性实验策略，从细胞、类器官到动物模型，并结合了生物信息学与分子动力学模拟。
1. 细胞模型构建与初步表征： * 研究对象： 使用了HCT116、DLD-1、HT29和SW480等多种人结直肠癌细胞系。通过慢病毒感染，构建了稳定过表达GFP（对照）和GFP-Nanog的细胞系。 * 处理方法： 通过形态学观察（鬼笔环肽染色显示丝状伪足）、划痕实验评估细胞迁移能力。利用蛋白质免疫印迹（Western Blot）初步检测过表达Nanog对EMT标志物（E-cadherin, Vimentin, Snail, ZEB1）、ERK通路（p-ERK1/2）和GSK-3β/β-catenin通路（p-GSK-3β, β-catenin）蛋白表达的影响。
2. 体内验证： * 研究对象： 将HCT116 GFP和HCT116 GFP-Nanog细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）中，构建异种移植瘤模型。 * 实验方法： 对肿瘤组织进行免疫组织化学（IHC）染色，并使用H-score定量分析Nanog、p-GSK-3β、β-catenin、Snail、E-cadherin等蛋白的表达水平及亚细胞定位，验证体外发现的通路激活情况。
3. 癌症干细胞特性与分裂模式分析： * 研究方法： * 结肠球形成实验： 在无血清干细胞培养基中培养细胞，形成3D结肠球，用于评估干性和自我更新能力。计数结肠球形成效率和大小分布。 * CD44报告基因系统： 使用CD44启动子驱动的RFP报告基因质粒，通过荧光显微镜和流式细胞术检测Nanog过表达对干细胞标志物CD44活性的影响。 * 细胞分裂模式分析（核心技术）： 采用BrdU脉冲-追踪和配对细胞分析。先用BrdU标记DNA，随后撤除BrdU并进行细胞周期同步化，固定后通过免疫荧光检测子代细胞中BrdU的分布。对称分裂表现为两个子细胞BrdU信号均等，不对称分裂则不均等。同时，共染色CD44，分析干细胞标志物在分裂中的分配模式。
4. 药物敏感性评估与机制探索： * 研究对象： 结直肠癌细胞系及患者来源的类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）。研究纳入了8个PDO系，根据Nanog表达水平分为高（Nanoghigh）和低（Nanoglow）两组。 * 药物处理： * 细胞毒性测定： 使用磺酰罗丹明B（SRB）法测定MEK抑制剂U0126和GSK-3β抑制剂TDZD-8对细胞的半数抑制浓度（IC50）。 * 功能实验： 用亚细胞毒性的药物浓度（20 μM U0126, 10 μM TDZD-8）处理细胞，观察对结肠球形态、克隆形成能力以及BrdU标记的对称分裂比例的影响。 * PDO药敏实验： 将PDO与临床药物（西妥昔单抗Cetuximab、贝伐珠单抗Bevacizumab、雷莫西尤单抗Ramucirumab）单独或联合U0126/TDZD-8处理，通过WST-1比色法连续监测7-8天，评估代谢活性（细胞活力）。 * 机制实验： * 信号通路检测： Western Blot分析药物处理后ERK和GSK-3β磷酸化水平以及EMT标志物的变化。 * 转录活性报告基因实验： 使用TOPflash/FOPflash报告系统检测Wnt/β-catenin通路活性；使用Nanog启动子荧光素酶报告基因检测Nanog的转录活性。 * 蛋白稳定性实验： 用放线菌酮（CHX）抑制新蛋白合成后，加入药物，通过Western Blot观察Nanog蛋白的降解速率。 * 染色质免疫沉淀（ChIP）： 用抗Nanog抗体沉淀与Nanog结合的染色质，通过qPCR检测Nanog自身以及下游靶基因（如CDK4, ZEB2, LGR5）启动子区域的占有率，评估药物是否影响Nanog与DNA的结合。
5. 分子相互作用与计算模拟： * 分子动力学模拟（创新方法）： 为了在原子水平理解抑制剂如何干扰Nanog功能，研究团队进行了扩展的分子动力学模拟。 * 模拟系统： 构建了多个系统进行对比模拟：单独的Nanog、单独的DNA、Nanog-DNA复合物、以及Nanog-DNA复合物分别与Amcasertib（已知的Nanog抑制剂）、多个Amcasertib分子、TDZD-8或U0126分子结合的状态。 * 模拟流程： 使用GROMACS软件，在类血液条件下进行长达200纳秒（ns）的全原子模拟。采用CHARMM和AMBER力场。 * 分析指标： 计算并比较了各系统的均方根偏差（RMSD，衡量结构稳定性）、均方根涨落（RMSF，衡量残基柔性）、回转半径（Rg）、结合自由能、溶剂可及表面积（SASA）以及氢键（H-bond）的数量和分布。特别关注了药物结合后Nanog-DNA界面关键接触残基的动态变化。 * E-cadherin相互作用建模： 使用分子对接和模拟，研究了胞质Nanog是否通过影响E-cadherin的胞内结构域，进而干扰E-cadherin的同源（cis）和异源（trans）二聚化，以及其与β-catenin/α-catenin复合物的结合，从结构角度解释Nanog促进EMT的潜在机制。
6. 临床数据与生物信息学分析： * 数据来源： 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中提取结直肠腺癌患者的mRNA测序和临床数据。 * 分析方法： 分析Nanog mRNA表达与临床分期、复发状态、总生存期的相关性。计算Nanog与EMT相关因子（ZEB1, SNAI1, CDH1）、β-catenin（CTNNB1）和GSK3B的基因表达相关性（Pearson系数）。同时，对收集的临床结直肠癌组织样本（健康邻近组织、腺癌组织、晚期肿瘤）进行Western Blot，验证蛋白水平的共表达模式。
四、 主要研究结果
1. Nanog过表达激活EMT和ERK/GSK-3β/β-catenin通路： 体外实验显示，过表达Nanog的细胞形态从铺路石状变为纺锤形，丝状伪足更长，迁移能力显著增强。Western Blot证实，Nanog过表达导致上皮标志物E-cadherin下调，间质标志物Vimentin以及转录因子Snail、ZEB1上调。同时，p-ERK1/2（激活态）和p-GSK-3β（Ser9，失活态）水平升高，而总GSK-3β降低，导致下游β-catenin积累。小鼠异种移植瘤的IHC结果完美印证了这些发现：Nanog过表达组肿瘤中，Nanog、p-GSK-3β、β-catenin、Snail表达显著升高，而E-cadherin降低。相关性分析显示，p-GSK-3β与Nanog表达呈强正相关。
2. Nanog驱动结直肠癌干细胞的自我更新和对称分裂： Nanog过表达显著提高了所有测试细胞系的结肠球形成效率。CD44报告基因显示Nanog过表达细胞中CD44阳性细胞比例增加，结肠球免疫荧光显示CD44表达上调而分化标志物MUC2下调。最关键的发现之一来自BrdU配对细胞实验：在对照细胞中，不对称分裂（59%）略占优势；而在Nanog过表达细胞中，对称分裂比例（66%）显著高于对照组（41%）。且CD44与BrdU在子细胞中共定位的比例在Nanog过表达组也更高。这直接证明Nanog促进了结直肠癌干细胞样细胞向对称分裂模式的转变，从而可能导致干细胞池的扩增。
3. Nanog过表达导致对U0126和TDZD-8的耐药，但两抑制剂可逆转其促干性表型： SRB实验显示，Nanog过表达细胞的IC50值（U0126: 146.3 μM; TDZD-8: 92 μM）显著高于对照细胞（93 μM和81.18 μM），表明产生了耐药性。PDO实验进一步验证，高表达Nanog的类器官对这两种抑制剂的敏感性更低。然而，当使用亚细胞毒性的抑制剂浓度处理时，它们能够有效干扰Nanog的功能：U0126降低了p-ERK1/2和β-catenin；TDZD-8增加了p-GSK-3β（失活）并降低了总GSK-3β。两种处理均能逆转Nanog过表达引起的EMT标志物变化，并显著降低对称分裂的比例。在PDO联合用药实验中，统计分析表明，Nanog表达状态（Nanoghigh vs. Nanoglow）显著影响了PDO对贝伐珠单抗、雷莫西尤单抗与U0126/TDZD-8联合治疗的代谢反应，存在显著的时间×Nanog×抑制剂的交互作用，凸显了基于Nanog水平进行个性化联合治疗的潜力。
4. Nanog处于Wnt/β-catenin通路的上游并受蛋白稳定性调控： 报告基因实验表明，GSK-3β抑制剂LiCl激活的Wnt/β-catenin转录活性可被Nanog抑制剂Amcasertib或转录抑制剂放线菌素D（ActD）阻断，提示Nanog是该通路转录输出所必需的。CHX追踪实验显示，U0126和TDZD-8处理加速了Nanog蛋白的降解，表明这两种激酶抑制剂可能通过影响Nanog的蛋白稳定性来发挥作用。
5. 分子模拟揭示抑制剂直接干扰Nanog-DNA结合： 这是本研究方法学上的亮点和创新。分子动力学模拟结果表明： * 结合模式： TDZD-8和U0126能够以较高的亲和力（结合能<-6.0 kcal/mol）与Nanog-DNA复合物结合。 * 结构扰动： 抑制剂结合后，Nanog-DNA复合物的氢键网络被显著扰乱，关键接触残基的溶剂可及性发生变化，整体结合界面稳定性降低。 * 特异性影响： 每种抑制剂都诱导了独特的氢键分布和局部构象变化（如特定残基的二级结构波动），但关键的α-螺旋结构得以保留。模拟预测，这种药物诱导的界面松动会损害Nanog与DNA的功能性结合。
6. 实验验证模拟预测：Nanog-DNA结合被破坏： ChIP实验为计算模拟提供了直接的实验证据。与DMSO对照组相比，用TDZD-8或U0126处理的细胞，其染色质免疫沉淀下来的Nanog蛋白量显著减少。更重要的是，ChIP-qPCR显示，药物处理后，Nanog在其自身启动子以及下游靶基因ZEB2、CDK4、LGR5启动子区域的占有率下降。竞争性ELISA/WB实验也证实，抑制剂能剂量依赖性地减少重组Nanog蛋白与生物素化DNA探针的结合。这些结果共同证实，U0126和TDZD-8能够直接或间接地干扰Nanog与DNA的相互作用。
7. 胞质Nanog可能通过结构干扰破坏E-cadherin粘附： IHC定量显示Nanog在胞质和核内均过表达。分子建模和模拟提出一个新颖的机制：胞质中的Nanog可能与E-cadherin的胞内结构域结合。模拟显示，这种结合可能改变E-cadherin跨膜螺旋的倾斜角度，削弱E-cadherin分子间（trans）和分子内（cis）的相互作用能，同时影响其与β-catenin的结合，从而从结构力学层面促进细胞-细胞粘附的解离，利于EMT发生。
五、 研究结论与价值
本研究系统阐明了转录因子Nanog在结直肠癌耐药和干细胞特性维持中的核心作用及其分子机制。主要结论是：Nanog通过激活ERK和GSK-3β/β-catenin信号通路，驱动上皮-间质转化（EMT），并促使结直肠癌干细胞样细胞从不对称分裂转向对称分裂，从而增强其自我更新能力、干性并导致对化疗靶向药物的耐药。
本研究的重要科学价值在于： 1. 机制创新： 首次将Nanog与结直肠癌干细胞的分裂模式调控直接联系起来，并明确了ERK/GSK-3β/β-catenin通路在此过程中的介导作用。 2. 干预策略创新： 发现临床上用于靶向其他通路的激酶抑制剂U0126（MEK抑制剂）和TDZD-8（GSK-3β抑制剂），能够直接干扰Nanog与DNA的结合，降低其转录活性，从而逆转由Nanog过表达引起的干细胞特性和EMT表型。 3. 方法学整合： 成功将分子动力学模拟与湿实验相结合，不仅预测了药物作用的新靶点（Nanog-DNA界面），并通过系列实验验证了该预测，为计算机辅助药物发现提供了范例。 4. 转化医学意义： 提出了一个具有潜力的治疗新策略：即利用U0126和TDZD-8等小分子抑制剂靶向Nanog及其下游通路，以消除结直肠癌干细胞，恢复肿瘤对现有疗法（如西妥昔单抗、贝伐珠单抗）的敏感性。研究提示，患者肿瘤的Nanog表达水平可能作为预测此类联合治疗疗效的生物标志物。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究还通过TCGA数据库和患者样本分析，在人群水平证实了Nanog表达与EMT标志物、β-catenin以及不良临床参数的相关性，加强了研究发现的临床相关性。此外，对患者来源类器官（PDO）的药敏测试，特别是联合用药的分析，体现了向精准医疗和个性化治疗策略的探索，具有很高的应用参考价值。