本研究是一项由Yuxuan Zhang, Jie Liu, Yunzhao Mo, Zetao Chen, Taoliang Chen, Yan Li, Yaofeng Zheng, Shaokang Deng, Xiangdong Xu, Huajian Chen, Haoqi He, Jiansheng Chen, Tao Jin, Xinlin Sun, Yiquan Ke, Jihui Wang 共同完成的原创性研究。第一作者单位为南方医科大学珠江医院神经外科（国家临床重点专科、教育部工程技术研究中心、广东省脑功能修复与再生重点实验室），部分作者来自中山大学附属汕头医院（汕头市中心医院）神经外科。该研究于2022年4月13日发表在学术期刊 Stem Cells International（卷2022，文章ID 6430565）上。
学术背景 本研究属于肿瘤治疗学，特别是细胞治疗与靶向药物递送领域。胶质瘤是一种常见的难治性颅内恶性肿瘤，传统的手术、放疗和化疗预后不佳。因此，开发新的治疗策略，如靶向分子治疗、免疫治疗、基因治疗和新型药物递送技术成为研究热点。其中，基于细胞的主动靶向药物递送系统因其固有的靶向能力、生物相容性和宿主整合潜力而备受关注。
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因其天然的肿瘤趋向性（tumor tropism）、抗肿瘤和免疫调节特性，被视为有潜力的治疗工具或药物载体。然而，MSCs在体外培养时存在传代次数有限、容易衰老以及不同来源或个体间存在异质性等问题，这严重阻碍了基于MSCs的临床前研究和长期应用。为解决这些问题，研究人员尝试对MSCs进行“永生化”（immortalization），以获得稳定、充足、均一的细胞来源。尽管已有研究构建了永生化MSC细胞系（如通过转染Bmi1和TERT基因），但其安全性，特别是在脑内应用时的安全性，仍需深入验证。此外，除了全细胞，MSCs的细胞膜（plasma membrane）因其富含介导归巢功能的受体和跨膜蛋白，作为生物相容性更好、更安全的仿生药物载体也显示出巨大潜力。
因此，本研究旨在首次系统性评估永生化间充质干细胞（im-MSCs）作为胶质瘤治疗载体（包括全细胞和细胞膜载体）的安全性和可行性。具体目标包括：1）构建并表征永生化人脐带MSCs（im-hUCMSCs）和人脂肪MSCs（im-hADSCs）；2）在体外和体内（尤其是脑内）全面评估im-MSCs的致瘤性（tumorigenicity）；3）验证im-MSCs细胞膜被胶质瘤细胞摄取的能力及其在体内靶向原位胶质瘤的能力。
详细研究流程 本研究包含多个紧密关联的实验流程，主要研究对象为人脐带MSCs（hUCMSCs）、人脂肪MSCs（hADSCs）及其对应的永生化细胞系（im-hUCMSCs, im-hADSCs），以及胶质瘤细胞系U87、U251和正常胶质细胞HA1800。
1. 永生化MSCs的构建与基础表征 * 流程： 使用慢病毒（lentivirus）分别携带端粒酶逆转录酶基因（TERT）和原癌基因Bmi1，以感染复数（MOI）为50转染原代hUCMSCs和hADSCs。转染72小时后，使用嘌呤霉素（puromycin）或G418进行筛选和维持，获得稳定过表达TERT和Bmi1的im-MSCs。 * 实验与对象： * 免疫表型分析： 对传代至第5代（P5）的原代MSCs和传代至第10代（P10）的im-MSCs，使用流式细胞术检测CD11b、CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105等表面标志物，验证其是否符合国际细胞与基因治疗学会（ISCT）对MSCs的定义标准。 * 多向分化潜能验证： 将P10的MSCs和im-MSCs分别进行成脂、成骨和成软骨诱导分化，并通过油红O、茜素红和阿利新蓝染色进行鉴定。 * 功能特性评估： * 促血管生成能力： 收集MSCs和im-MSCs的条件培养基，处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过内皮细胞管形成实验（tube formation assay）评估其促血管生成能力。 * 免疫抑制能力： 将丝裂霉素C处理的MSCs或im-MSCs与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，并用植物血凝素-L（PHA-L）刺激PBMCs，通过CCK-8法检测PBMCs的增殖，评估im-MSCs的免疫抑制功能。 * 永生化基因表达验证： 使用实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测TERT和Bmi1在mRNA和蛋白水平的表达。 * 增殖能力评估： 使用CCK-8法和EdU（5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷）掺入实验，比较MSCs和im-MSCs的增殖能力。同时记录im-MSCs的群体倍增水平（PDLs）。
2. im-MSCs的安全性评估 * 流程： 从遗传稳定性、体外致瘤性和体内致瘤性三个层面进行评估。 * 实验与对象： * 遗传稳定性分析（体外）： 对长期培养后的im-hADSCs（P55）和im-hUCMSCs（P30）进行核型分析（karyotyping），检查染色体是否异常。 * 体外致瘤性评估（软琼脂克隆形成实验）： 将U87、U251（阳性对照）、HA1800（阴性对照）、原代MSCs和im-MSCs分别混入软琼脂中培养2-3周，观察是否能形成克隆集落（colony formation）。 * 与胶质瘤细胞共培养后的安全性： 将MSCs/im-MSCs与U87细胞在Transwell中间接共培养48小时后，检测MSCs增殖的变化，并再次进行软琼脂克隆形成实验，评估共培养是否会诱导MSCs恶性转化。 * 体内致瘤性评估（小鼠模型）： * 脑内注射模型： 构建表达荧光素酶（luciferase）报告基因的im-hUCMSCs、原代hUCMSCs、HA1800（阴性对照）和U87-luc（阳性对照）细胞。将1×10^6个细胞立体定向注射入4周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧额叶脑实质内。在第4、7、14天，通过活体成像系统（IVIS）监测细胞在脑内的生长情况。实验结束时，取脑组织进行H&E染色，检查注射部位有无异常组织增生。 * 皮下注射模型： 将im-hUCMSCs皮下注射到裸鼠右下肢近端，观察14天内有无肿瘤形成。
3. im-MSCs细胞膜作为药物载体的潜力评估 * 流程： 提取并表征im-MSCs的细胞膜，评估其被肿瘤细胞摄取的能力以及在体内的肿瘤靶向能力。 * 实验与对象： * 细胞膜提取与表征： 通过差速离心结合超声破碎的方法从im-MSCs中分离纯化细胞膜（PM）。使用透射电镜（TEM）观察膜的形态和尺寸（约100-150 nm）。通过SDS-PAGE和Western blot比较全细胞裂解液和细胞膜组分的蛋白谱差异，并使用膜蛋白标志物ATP1A1、胞质蛋白β-actin和GAPDH进行验证。 * 肿瘤趋向分子表达分析： 通过RT-qPCR检测不同传代次数的MSCs和im-MSCs中关键归巢分子CXCR4和PSGL-1（SELPLG）的mRNA表达水平，评估其长期表达的稳定性。 * 体外摄取实验： 用荧光染料DiO标记im-MSCs细胞膜，然后与胶质瘤细胞U87或U251共培养不同时间（0.5-12小时）。通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测胶质瘤细胞对荧光标记细胞膜的摄取率和细胞内定位。 * 体内靶向实验（小鼠原位胶质瘤模型）： * 模型建立： 将U87-luc细胞立体定向注射到裸鼠脑内，建立原位胶质瘤模型。 * 靶向验证： 在植瘤第7天，通过尾静脉注射用近红外荧光染料DiR标记的im-hUCMSCs细胞膜。以DiR标记的红细胞膜（RBC-PM，缺乏归巢分子）作为对照。使用IVIS在注射后0.5、2、6、12、24、48、72小时动态观察荧光信号在体内的分布，特别关注肿瘤部位的信号积累。
4. 数据分析 * 所有数据均以均值±标准差表示。 * 使用SPSS 20.0或GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。 * 组间差异显著性采用t检验或方差分析（ANOVA）进行评估，P值小于0.05被认为具有统计学意义。
主要研究结果 1. im-MSCs保留了MSCs的基本特性与功能： * 免疫表型与分化潜能： 流式结果显示，im-MSCs与原代MSCs一样，高表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b，符合ISCT标准。诱导分化实验证实，im-MSCs在体外仍能成功分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。这表明永生化过程没有改变MSCs的基本身份。 * 功能特性： im-MSCs的条件培养基能显著促进HUVEC的血管形成，且与原代MSCs无显著差异。在与PHA-L活化的PBMCs共培养实验中，im-MSCs展现出与原代MSCs相似的免疫抑制能力，尽管不同来源的MSCs（hUCMSCs vs hADSCs）及其永生化版本之间抑制效能存在一些统计学上的差异。这些结果表明im-MSCs保留了MSCs的关键功能。 * 增殖与遗传稳定性： CCK-8和EdU实验均证实，im-MSCs的增殖能力显著强于原代MSCs。im-hADSCs可稳定传代超过60个PDLs，im-hUCMSCs超过30个PDLs。更重要的是，对长期培养后的im-MSCs进行核型分析，未发现明显的染色体异常，证明了其遗传稳定性。
2. im-MSCs在体外和体内均未表现出致瘤性： * 体外安全性： 软琼脂克隆形成实验中，阳性对照U87和U251形成了明显的克隆集落，而HA1800、原代MSCs以及两种im-MSCs均未形成任何集落。这表明im-MSCs在体外缺乏锚定非依赖性生长能力，这是恶性转化的一个重要标志。 * 与肿瘤共培养的安全性： 间接共培养实验发现，U87细胞的存在能增强MSCs和im-MSCs的增殖能力。然而，即使经过共培养，这些MSCs在随后的软琼脂实验中依然无法形成克隆，表明这种增殖增强并未赋予其恶性特征。 * 体内安全性（核心发现）： * 脑内模型： IVIS活体成像显示，注射入裸鼠脑内的U87-luc细胞（阳性对照）持续生长并最终导致小鼠死亡。而注射im-hUCMSCs、原代hUCMSCs或HA1800（阴性对照）的裸鼠，其脑内荧光信号在短暂存在后逐渐减弱直至消失，并未持续增长。H&E染色进一步证实，im-MSCs注射部位仅见针道痕迹，未见异常组织或肿瘤形成。 * 皮下模型： 皮下注射im-hUCMSCs 14天后，注射部位无肿瘤形成。 * 这些强有力的体内外证据共同表明，本研究构建的im-MSCs不具有致瘤性，即使直接植入脑内这一高风险环境也是安全的。
3. im-MSCs及其细胞膜具有作为胶质瘤靶向载体的潜力： * 归巢分子持续表达： RT-qPCR分析显示，在长期传代过程中，im-MSCs持续表达关键的肿瘤归巢分子CXCR4和SELPLG。值得注意的是，在某些传代节点，im-MSCs中SELPLG的表达水平甚至高于原代MSCs。这为im-MSCs及其细胞膜的靶向功能提供了分子基础。 * 细胞膜被胶质瘤细胞高效摄取： 透射电镜证实提取的细胞膜为囊泡状结构，尺寸适宜穿越血脑屏障。Western blot验证了提取物富含膜蛋白（ATP1A1），而胞质蛋白污染很少。体外摄取实验显示，DiO标记的im-MSCs细胞膜能被U87和U251细胞高效内吞，流式结果显示摄取率随时间增加，共聚焦显微镜下可见荧光信号定位于癌细胞内部。 * 细胞膜在体内特异性靶向原位胶质瘤： 在携带原位U87胶质瘤的裸鼠模型中，尾静脉注射DiR标记的im-hUCMSCs细胞膜后，IVIS成像显示荧光信号随时间在脑肿瘤部位特异性聚集，并在注射后24-48小时达到峰值，随后缓慢下降。相比之下，注射缺乏归巢分子的RBC-PM的对照组，其在肿瘤部位的信号积累显著较弱且延迟。这直接证明了im-MSCs细胞膜凭借其表面的归巢分子，能够实现主动靶向，并优先聚集于脑胶质瘤部位。
结论 本研究首次系统性评估并证实了永生化间充质干细胞（im-MSCs）作为治疗胶质瘤的细胞或细胞膜载体的安全性与可行性。核心结论如下： 1. 安全性确立： 通过慢病毒介导的TERT和Bmi1基因共表达构建的im-MSCs，在长期培养后仍保持正常的核型，在体外无克隆形成能力，在体内（包括直接脑内注射）无致瘤性。即使与胶质瘤细胞共培养，也未获得恶性特征。这为解决MSCs临床应用中的细胞来源短缺和异质性难题提供了一个安全、稳定、充足且质量可控的细胞来源。 2. 功能与靶向性保留： im-MSCs保留了原代MSCs的免疫表型、多向分化潜能、促血管生成和免疫抑制等功能特性。更重要的是，其持续表达CXCR4等归巢分子。 3. 新型载体潜力验证： im-MSCs的细胞膜能够被胶质瘤细胞高效摄取，并能在体内主动靶向并富集于原位胶质瘤。这表明，im-MSCs的细胞膜可以作为一种天然的、生物相容性高的仿生药物载体，用于实现针对胶质瘤的靶向药物递送，规避全细胞治疗潜在的远期风险。
研究的意义与价值 * 科学价值： 本研究不仅回答了关于永生化干细胞安全性的关键质疑，特别是其在敏感器官（脑）内的安全性，还为基于MSCs的肿瘤治疗策略提供了新的思路。它将研究视角从传统的“全细胞治疗”拓展到了“细胞膜仿生载体”，丰富了细胞治疗学的工具箱。 * 应用价值： * 治疗载体： im-MSCs可作为安全的“活体工厂”，用于长期分泌抗肿瘤因子或携带治疗基因。其细胞膜可用来包载化疗药物、核酸药物等，构建具有主动靶向能力的纳米药物，提高疗效并降低全身毒性。 * 研究工具： 均一且无限的im-MSCs细胞系是进行MSCs生物学、肿瘤-微环境相互作用、药物筛选等基础研究的理想模型。 * 临床转化前景： 该研究为开发下一代针对胶质瘤等实体瘤的靶向治疗产品奠定了坚实的临床前基础。基于im-MSCs细胞膜的仿生纳米药物，有望克服血脑屏障和肿瘤靶向性两大难题。
研究亮点 1. 研究问题的创新性与重要性： 首次聚焦于评估im-MSCs作为胶质瘤治疗载体的脑内安全性，这是其走向临床应用的必经之路和核心关切。 2. 系统性、多层次的安全性评估： 研究设计非常全面，从基因表达、染色体核型、体外克隆形成，到体内皮下和关键性的颅内原位安全性验证，构成了一个完整而严谨的证据链。 3. “全细胞”与“细胞膜”双轨并行的研究策略： 不仅验证了永生化全细胞的安全性，更前瞻性地探索了其细胞膜作为无细胞、低风险新型载体的巨大潜力，体现了研究的深度和前瞻性。 4. 明确的转化医学导向： 所有实验均紧密围绕“治疗胶质瘤”这一临床难题展开，从载体构建、安全验证到功能（靶向性）验证，逻辑清晰，目标明确，具有明确的临床转化意义。
其他有价值的内容 研究还观察到了不同来源MSCs（脐带 vs 脂肪）在功能（如免疫抑制能力）上存在差异，提示在未来的应用中需要根据治疗目的选择合适的MSCs来源进行永生化。此外，研究也承认，使用慢病毒进行基因改造可能带来临床转化障碍，并建议未来可探索非整合基因传递方式（如电转染）或非遗传方法（如蛋白质转导）来实现MSCs的永生化或功能增强，这为后续技术优化指明了方向。