一种用于NADPH敏感原位前药激活的核壳结构反应器：ZIF-8分隔酶与前药的研究报告
一、 主要作者、机构与发表信息
本研究由来自中国药科大学和南京大学的多位学者合作完成。主要作者包括Bo Wang, Sheng Zhang (两位并列一作), Zi-Tao Shen, Ting Hou, Yi-Han Zhao, Meng-Sheng Huang, Jian Li, Huan Chen, Peng-Hui Hu, Zi-Jiang Luo, Shuai Yuan, Feng-Min Wang, Wei Li, Chang Shu, Xing-Hua Xia以及通讯作者Ya Ding。相关研究人员分别来自中国药科大学的药物质量控制和药物警戒教育部重点实验室、生命科学与技术学院生物化学系，以及南京大学的生命分析化学国家重点实验室、配位化学国家重点实验室和介观化学教育部重点实验室。该研究成果于2023年发表在*Angewandte Chemie International Edition*期刊上，文章编号为e202314025。
二、 学术背景与研究目的
本研究的核心科学领域属于生物医药与纳米技术的交叉领域，具体涉及酶-前药疗法 (Enzyme-Prodrug Therapy)和金属-有机框架 (Metal–Organic Frameworks, MOFs)材料在药物递送与疾病治疗中的应用。酶-前药疗法因其在体内前药激活方面具有的高效性、选择性和特异性而展现出独特优势。然而，该疗法在实际应用中面临三大关键挑战：1）难以在靶点部位实现对酶及其底物（前药）的精确时空调控；2）酶活性在递送和肿瘤微环境中难以维持；3）由于前药递送效率低，易导致前药在激活位点被原位耗尽，限制了治疗效果。
细胞色素P450 (Cytochrome P450, CYP450)是肝脏微粒体系统的主要成分，也是多种前药（如环磷酰胺、氟他胺、5-氟尿嘧啶）的关键生物代谢酶。然而，CYP450在肝脏中高表达，导致前药转化主要在肝脏进行，活性药物需通过全身循环到达病灶，这会引起严重的肝毒性和潜在的系统毒性。同时，CYP450的活性易受个体差异和环境因素影响。因此，如何设计一种既能将酶和前药共递送至肿瘤部位，又能保护甚至增强酶活性，并避免前药过早耗尽的系统，是当前研究的重要方向。
金属-有机框架 (MOFs)材料因其超大的比表面积、可调的孔结构和良好的生物相容性，在酶固定化和药物递送方面显示出巨大潜力。尽管已有研究将酶和前药同时封装入ZIF-8等MOFs中，但这类材料的药物负载能力通常较低（<15%）。此外，固定的酶可持续催化，导致封装在有限空间内的前药被快速耗尽，反而限制了整体的酶激活效率。本研究团队此前曾提出利用前药作为有机配体直接构建MOFs的策略，即前药MOFs (Pro-MOFs)，虽然大幅提高了负载能力，但也因前药分子的低结构对称性引入了结构缺陷，可能导致酶泄漏和催化反应过早发生。
基于以上背景，本研究旨在解决酶-前药疗法中时空调控、酶活性维持和前药原位耗尽的核心问题。具体研究目标是：开发一种新型的核壳结构反应器，利用沸石咪唑酯骨架-8 (Zeolitic Imidazolate Framework-8, ZIF-8)将酶与前药分隔开，同时以前药作为配体构建外壳，从而在单一颗粒中整合酶与底物，并实现前药的高负载，最终构建一种能够在肿瘤细胞NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）浓度触发下进行原位、高效、选择性前药激活的智能递送系统。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个综合性、多步骤的系统工程，主要流程可概括为：材料设计与合成、结构与性能表征、体外催化活性评估、细胞水平验证、体内抗肿瘤疗效测试以及相关的机理研究。
1. 核心-壳层反应器的设计与制备 * 研究程序1：核壳结构前药壳层（ZD）的制备与表征。 * 研究对象与方法：首先，采用标准方法合成ZIF-8纳米颗粒作为核心。然后，选用四种含五元氮杂环的药物，包括达卡巴嗪 (Dacarbazine, DTIC)、替莫唑胺、来曲唑和6-硫鸟嘌呤，探索其与ZIF-8的配位能力。研究发现只有DTIC能在ZIF-8外部成功构建壳层，形成ZIF-8@DTIC复合物（简称ZD）。 * 实验与分析：通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）监测ZD的粒径、形貌变化。利用高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）配合能量色散X射线光谱（EDX）Mapping分析了元素的分布，证实了锌（Zn）和氮（N）在整个颗粒中均匀分布，而氧（O，来自DTIC的羰基）主要富集在颗粒外壳，直观证明了核壳结构。通过X射线衍射（XRD）结合高效液相色谱（HPLC）分析，阐明了外壳由Zn-DTIC配位化合物和少量DTIC晶体共同组成。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线光电子能谱（XPS）以及密度泛函理论（DFT）计算进一步证实了DTIC通过咪唑环、羰基和酰胺基团与Zn²⁺发生配位，且结合能高于ZIF-8原有的2-甲基咪唑（2-mim）。最终确定了最优制备条件，使ZD获得了高达43.6±0.8%的药物负载容量。
2. 体外酶活性评估 * 研究程序3：固定化CYP450的催化活性测定。 * 研究对象与方法：比较游离CYP450和固定在CZD中的CYP450（即CZD）对底物DTIC的催化能力。使用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）在多重反应监测（MRM）模式下，检测DTIC的典型代谢产物5-氨基-4-咪唑甲酰胺（AIC）。 * 实验与分析：实验设置关键对照组：无NADPH存在时，CZD没有催化活性。在NADPH存在下，CZD中固定化的CYP450催化活性约为游离CYP450的3.4倍。为进一步验证，还使用了CYP450 1A2亚型的特异性底物非那西丁（Pnt），结果同样显示固定化酶的活性显著提高。这表明MOF结构能够富集底物和辅酶因子，从而加速反应进程，并且该反应器的催化活性依赖于NADPH的存在，为肿瘤细胞选择性激活提供了理论基础。
3. 细胞水平的研究与机理探索 * 研究程序4：NADPH敏感的前药激活与细胞毒性。 * 研究对象：多种细胞系，包括小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）、人肝癌细胞（HepG2）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）以及正常细胞（人肝细胞L02和人脐静脉内皮细胞HUVECs）。 * 实验与分析： * 细胞毒性：CZD对多种肿瘤细胞均有明显毒性，其中对B16-F10细胞最敏感，其半数抑制浓度（IC50）为26.3±2.6 μg/mL，而对两种正常细胞影响很小。 * 选择性机理：测定细胞内NADPH/NADP⁺比值，发现B16-F10细胞中的比值显著高于L02和HUVECs细胞，这与CZD依赖NADPH激活的特性相符。 * 细胞内催化验证：通过LC-MS/MS检测细胞内的AIC产物。结果显示，在CZD处理的B16-F10细胞中，随着时间推移，AIC浓度和DTIC转化率显著增加（4小时为15.1±0.5%，24小时达36.5±1.5%），而在不含酶的ZD处理组中未检测到AIC。 * 细胞摄取与胞内命运：使用FITC标记的颗粒（FZD）研究摄取机制。通过流式细胞术结合抑制剂实验（氯丙嗪、染料木黄酮、渥曼青霉素），证实摄取主要通过网格蛋白介导的内吞作用。共聚焦显微镜（CLSM）观察显示，FZD被内吞后进入溶酶体，但在后续培养中荧光扩散至整个细胞质，表明颗粒实现了溶酶体逃逸，这归因于DTIC和2-mim中含有的咪唑基团产生的“质子海绵效应”。 * 细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI双染流式分析和CLSM活/死细胞染色均表明，CZD处理能有效诱导B16-F10细胞凋亡。
4. 体内抗肿瘤疗效评估 * 研究程序5：体内靶向与疗效评价。 * 研究对象：建立B16-F10黑色素瘤原位移植的C57BL/6J小鼠模型。每组5-6只小鼠。 * 实验与方法：为提高肿瘤靶向性，通过静电作用在CZD表面修饰了透明质酸（Hyaluronic Acid, HA），得到CZD@HA（简称CZDh）。设置了多个对照组：生理盐水、游离DTIC、未载酶的靶向颗粒（ZDH）、无靶向的酶反应器（CZD）以及靶向的酶反应器（CZDh）。通过尾静脉注射给药，剂量为5 mg DTIC/kg体重，每2天一次，共14天。 * 实验与分析： * 抗肿瘤效果：CZDh组显示出最强的肿瘤抑制效果，相对肿瘤体积（RTV）和最终肿瘤重量在所有组中最低，肿瘤抑制率高达96.6±1.9%，且治疗过程中有三只小鼠的肿瘤完全消退。 * 生物安全性：CZDh组小鼠体重下降最轻微，生存率为100%，显著优于其他治疗组。 * 体内分布：通过HPLC和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析DTIC和Zn元素在器官和肿瘤中的分布。结果显示，靶向的CZDh在肿瘤中的蓄积量显著高于肝脏等正常器官，证明了其精准的肿瘤靶向能力。 * 组织学分析：肿瘤组织的苏木精-伊红（H&E）染色和TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）染色显示，CZDh组肿瘤出现了最大面积的坏死和凋亡区域。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究的结果层层递进，逻辑严谨。首先，在材料合成阶段成功构建了具有明确核壳结构的ZD和CZD。关键表征数据（如EDX mapping、XRD、负载量）不仅证实了结构成功，其高负载能力（~43.6%）和pH响应性释放特性（pH 5.5下快速释放）为后续的细胞内激活和疗效奠定了基础。这是整个研究的“硬件”基础。
其次，体外酶活实验获得了决定性数据：固定化CYP450的活性是游离酶的3.4倍，且严格依赖NADPH。这一结果直接支持了设计的核心机制——反应器在正常循环中保持惰性，而在富含NADPH的肿瘤细胞内被“唤醒”。这为细胞选择性杀伤提供了直接的理论依据。
随后，细胞水平的结果完美验证了上述机制。B16-F10细胞具有更高的NADPH/NADP⁺比值，CZD对其展现出了低IC50和高选择性毒性。细胞内检测到随时间增加的AIC代谢产物，是“原位催化”的直接证据。同时，摄取（网格蛋白途径）和溶酶体逃逸机理的阐明，解释了反应器如何成功将酶和前药递送至细胞质这一催化发生的“车间”。
最后，动物实验结果是所有前期工作的集成体现。CZDh组卓越的抗肿瘤效果（96.6%抑制率）和安全性（100%存活），直接归因于HA介导的肿瘤主动靶向所实现的药物在肿瘤部位的高蓄积（体内分布数据支持），以及核壳反应器在肿瘤细胞内成功实现的前药高效、持续激活。组织病理学结果（坏死、凋亡）则为治疗效果提供了形态学证据。整个结果链条从材料设计、机理验证到最终疗效，形成了完整的闭环。
五、 研究结论与价值
本研究成功提出并验证了一种基于ZIF-8分隔酶与前药的核壳结构CYP450反应器，用于实现NADPH敏感的原位前药激活。该反应器集成了酶与前药，具有高负载、酶活性增强、pH响应释放、NADPH选择性激活以及主动肿瘤靶向等多重功能。其科学价值在于：1）为解决酶-前药疗法的核心瓶颈（时空调控、酶活性维持、底物耗尽）提供了一种创新性的材料学解决方案；2）深化了MOFs在生物催化与智能药物递送领域中的应用，展示了通过精巧的结构设计（核壳分隔）实现复杂生物功能的潜力；3）揭示了利用肿瘤细胞特有的代谢物（如高NADPH水平）作为触发信号的精准治疗新策略。
其应用价值非常明确：该策略为恶性肿瘤（尤其是黑色素瘤）的治疗提供了一种高效、高选择性且安全的潜在新型疗法。通过将“药物合成工厂”精准投送到癌细胞内部并持续“生产”活性药物，可以最大限度地提高疗效并降低全身毒性。这种核壳反应器设计思路具有普适性，可望拓展至其他需要酶催化激活的疾病治疗领域。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
本研究还体现了多学科交叉融合的特点，综合运用了合成化学、材料表征（多种先进显微和光谱技术）、计算化学（DFT）、酶动力学、细胞生物学、药理学和动物实验等多种研究手段。此外，文章对反应器稳定性（在不同生理介质中）、生物相容性（溶血实验）以及潜在副作用（血清生化和器官组织学）也进行了充分评估，增加了研究的严谨性和临床转化潜力。作者在讨论中指出，这种核壳反应器策略为处理酶-前药疗法领域的几乎所有问题提供了一个新颖而直接的思路，并丰富了基于ZIF-8的生物应用。