一份高灵敏无标记表面增强拉曼散射传感平台用于阿尔茨海默病早期诊断的学术研究报告

本报告旨在介绍由Qisheng Luo、Xin Kang、Chunyuan Zhang、He Zhang、Yongning Huang、Qianli Tang、Xianjiu Liao、Fenglei Gao 和 Zhao Liu* 共同完成的一项创新性研究工作。该研究发表于英国皇家化学学会（RSC）旗下的知名期刊《Analyst》上，具体为2025年的第150卷，页码自264至271。研究团队主要来自中国多家高校及附属医院，包括右江民族医学院附属医院（广西骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室）、右江民族医学院（桂西高发病防治重点实验室）、徐州医科大学药学院以及徐州医科大学附属医院甲乳外科。

一、 研究的学术背景 本研究的核心科学领域是生物传感与生物分析化学，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease, AD）的早期分子诊断技术开发。阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其早期、准确的诊断对于疾病干预和治疗至关重要。淀粉样β蛋白寡聚体（Amyloid-β Oligomers, AβOs）被广泛认为是AD发病过程中关键的毒性物质和早期生物标志物，其浓度变化早于明显的临床症状和斑块形成。因此，发展能够高灵敏、高特异性地检测体液中（如血清）极低浓度AβOs的方法，具有重大的科学意义和临床价值。

然而，现有的检测技术面临挑战。例如，传统的酶联免疫吸附测定法（ELISA）虽然常用，但存在制备复杂、稳定性欠佳、成本高以及抗体结合亲和力有限等局限性，难以满足早期诊断对超高灵敏度的需求。另一方面，基于表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）的传感技术具有无损、快速、指纹识别能力强、受水干扰小等优点，非常适合痕量物质的检测。但传统的标记型SERS传感器过程繁琐，而无标记策略又往往受限于信号转导效率，导致许多现有SERS系统在AD早期诊断中未能取得满意效果。

针对上述问题，本研究旨在构建一种新型的无标记SERS生物传感平台。其核心目标是：整合多种核酸等温扩增技术，设计一种级联信号放大策略，以实现对AβOs的超高灵敏度、高特异性检测，并验证其在真实生物样本（人血清）中的应用潜力，为AD的早期分子诊断提供一种强有力的新工具。

二、 研究详细工作流程 本研究的工作流程是一个精心设计的、多步骤的生物化学与材料科学相结合的过程，主要包含以下几个关键程序：

1. 传感界面的构建与目标物识别：

   • 研究材料与处理： 使用光学玻璃作为基底。首先将其在食人鱼溶液（过氧化氢与硫酸混合）中浸泡12小时进行彻底清洁和羟基化。随后，使用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）进行硅烷化处理，在基底表面引入氨基基团。
   • 分子信标固定化： 将肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）分子信标MB2溶液滴加至硅烷化的基底表面，通过氨基与PNA末端的化学反应，将MB2共价固定在基底上。
   • 近端杂交复合物形成： 研究使用两种分别用DNA序列（DNA1和DNA2）标记的AβO特异性抗体（Ab-DNA1和Ab-DNA2）。当目标物AβOs存在时，两个抗体通过特异性识别结合到同一个AβO分子上，使得连接的DNA1和DNA2在空间上相互靠近，发生部分杂交，形成“Ab-DNA1-AβO-Ab-DNA2”三元近端杂交复合物。

2. 催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly, CHA）引发的第一级信号放大：

   • 工作原理： 固定在基底上的MB2和溶液中的另一个分子信标MB1（其序列经过特殊设计）最初处于稳定的发夹结构。近端杂交复合物中的DNA序列（来自DNA1和DNA2的杂交部分）可以作为“催化剂”，与MB1作用，打开其发夹结构。被激活的MB1随即与基底上的MB2发生杂交，形成双链，并将催化剂序列置换释放出来。被释放的催化剂可以循环使用，去激活更多的MB1，从而引发链式反应。
   • 过程： 将含有AβOs、Ab-DNA1和Ab-DNA2的混合物加到固定有MB2的基底上，在37°C下孵育特定时间（后续优化为100分钟）。在此过程中，每个AβO分子催化的CHA反应能在基底表面产生大量MB1-MB2杂交双链。重要的是，此过程不消耗AβO目标物，实现了对目标物的循环利用和信号的一次放大。

3. 杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction, HCR）引发的第二级信号放大：

   • 工作原理： 当MB1与MB2杂交后，MB2的末端会暴露出一个单链“粘性末端”。这个末端与另外两个设计好的发夹探针H1和H2互补。
   • 过程： 在CHA反应完成后，向体系中加入H1和H2探针。MB2暴露的粘性末端会打开H1的发夹结构，H1被固定并暴露出新的序列，此序列继而打开H2的发夹结构，H2杂交上来后又暴露出与H1初始粘性末端相同的序列，从而引发H1和H2的交替杂交，形成长的双链DNA串联体聚合物。这个过程在基底表面进行，显著增加了表面DNA的数量和长度（优化反应时间为80分钟）。HCR过程利用CHA产生的“引物”进一步将信号进行了几何级数的放大。

4. DNA模板化金属银沉积与SERS信号产生：

   • 银离子吸附： 经过CHA和HCR扩增后，基底表面覆盖了带有大量负电荷磷酸骨架的DNA长链。将基底浸入含有硝酸银的氨水溶液（pH 10.5）中，带正电的银离子（Ag⁺）通过静电作用被大量吸附到DNA骨架上。
   • 化学还原与银纳米颗粒生长： 洗净多余的银离子后，将基底转移到含有还原剂对苯二酚（氢醌）的氨水溶液中。对苯二酚将吸附在DNA上的Ag⁺原位还原为银原子，形成银纳米颗粒（Ag NPs）种子。随后，可通过额外的银增强步骤（silver enhancement）使这些纳米颗粒进一步长大，形成更密集、更大的银纳米结构。
   • SERS报告分子吸附与检测： 最后，将SERS活性分子罗丹明6G（Rhodamine 6G, R6G）滴加到沉积了银纳米颗粒的基底表面。R6G会吸附在银纳米颗粒表面。当用激光照射时，位于银纳米颗粒热点区域的R6G会产生极强的SERS信号。信号强度与银纳米颗粒的数量和形貌直接相关，而银纳米颗粒的数量又由DNA长链的数量决定，DNA长链的数量则由初始AβO的浓度通过两级放大所决定，从而建立起AβO浓度与SERS信号强度之间的定量关系。
   • 数据采集与分析： 使用拉曼光谱仪采集SERS信号。研究中以R6G在1508 cm⁻¹处的特征拉曼峰强度作为定量分析的指标。通过测量不同浓度AβO标准品对应的SERS强度，绘制标准曲线，建立线性回归方程，并计算检测限。

5. 性能评估与实际样本分析：

   • 优化实验： 研究系统优化了多个实验条件，包括银增强时间、R6G浓度、CHA反应时间和HCR反应时间，以获取最佳传感性能。
   • 选择性测试： 使用Aβ纤维（Aβ Fibrils）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、胰岛素、C反应蛋白（CRP）等作为潜在干扰物，测试传感器对AβOs的特异性。
   • 稳定性与重复性测试： 评估了传感器的批内重复性、批间重现性以及长期储存稳定性。
   • 实际样本检测： 采集了健康人和AD患者的血清样本，使用所构建的传感器进行检测，并与传统ELISA方法的检测结果进行对比，验证其实际应用可行性。

三、 研究主要结果 1. 传感原理验证与表征结果： 研究通过电化学阻抗谱（EIS）逐步验证了传感界面的成功构建。裸ITO电极阻抗很小（曲线a），固定MB2后阻抗显著增加（曲线b），表明绝缘性的核酸阻碍了电子传递。加入AβO形成复合物后，阻抗进一步增大（曲线c），证明了目标物的结合。进行CHA和HCR反应后，阻抗急剧上升（曲线d，e），反映了长链DNA聚合物在电极表面的形成，严重阻碍了电子传输。最后沉积银纳米颗粒后，阻抗下降（曲线f），归因于银优良的导电性。这一系列的EIS变化清晰地证实了每个步骤按设计发生。

1. 信号放大能力验证结果： SERS光谱结果直接证明了级联放大策略的有效性。在没有AβO时，基底几乎没有R6G的拉曼信号（曲线a）。加入AβO并沉积银后，出现了明显的拉曼峰（曲线b）。将CHA反应时间延长至100分钟后，信号进一步增强（曲线c），这是由于目标物循环催化产生了更多的MB1-MB2复合物。在此基础上进行HCR反应（80分钟），获得的SERS信号强度（曲线d）比未进行HCR时（曲线c）增强了约2.56倍，确凿地证明了HCR作为第二级放大器，通过增长DNA链负载了更多银纳米颗粒，从而极大地放大了最终信号。

2. 分析性能结果： 在最优条件下，该传感器对AβOs表现出卓越的分析性能。SERS信号强度在AβO浓度从10 fM（飞摩尔）到1 nM（纳摩尔）的宽范围内，与浓度的对数呈良好的线性关系。线性回归方程为 Y = 1831 log© + 25807，相关系数（R）为0.9845。根据信噪比（S/N=3）计算出的检测限低至4.6 fM。这一灵敏度显著优于文献中报道的多种基于电化学、电化学发光（ECL）和光电化学（PEC）的AβO检测方法（参见原文表1），凸显了本策略的优势。

3. 选择性、稳定性与实际应用结果： 选择性实验表明，传感器仅对AβOs产生强烈的SERS响应，而对高达10 pM浓度的Aβ纤维、TNF-α、胰岛素和CRP的响应信号可忽略不计，这归功于抗体对AβOs的特异性识别。传感器表现出良好的重复性（批内RSD为4.3%）和重现性（批间RSD为4.3%），并在4°C储存四周后仍能保持95.6%的初始信号，稳定性满足应用需求。最重要的是，在六份人血清样本（三份健康，三份患者）的检测中，本传感器测得的结果与传统ELISA方法的结果高度一致，且变异较小，充分证明了该方法在复杂生物基质中进行精准检测的潜力和可靠性。

四、 研究结论与价值 本研究成功地开发了一种基于近端杂交触发CHA-HCR级联放大和DNA模板化银沉积的无标记SERS生物传感器，用于超灵敏检测阿尔茨海默病关键生物标志物AβOs。

其科学价值在于：① 创新性地整合了多种信号放大机制：将免疫识别的高特异性、近端杂交的信号转换、CHA的目标物循环催化放大、HCR的指数型信号放大以及DNA模板化金属沉积的SERS信号增强有机结合起来，构建了一个高效、多层次的信号放大通路。② 提供了一种通用的蛋白质检测平台构建思路：该策略不依赖于酶，且无需对信号分子进行复杂标记，通过更换识别抗体，理论上可应用于其他蛋白质生物标志物的高灵敏检测。

其应用价值在于：① 为AD早期诊断提供了极具前景的新工具：所达到的fM级检测限足以应对早期患者体液中极低浓度AβOs的检测需求。② 展示了良好的临床转化潜力：方法在真实血清样本中验证成功，表现出高特异性、稳定性和准确性，为未来开发床旁（Point-of-Care）检测设备奠定了坚实的技术基础。

五、 研究亮点 1. 双重级联放大策略：创新性地将CHA与HCR两种等温扩增技术串联，实现了对单个目标物分子的多重信号放大，这是获得超高灵敏度的核心。 2. 无标记SERS检测：巧妙地利用DNA骨架的负电性吸附银离子，原位生成SERS活性基底，避免了复杂的拉曼报告分子标记过程，简化了操作，降低了成本。 3. 高灵敏度与低检测限：实现了4.6 fM的极低检测限，在当前AβO检测技术中处于领先水平。 4. 良好的实际应用性能：不仅在缓冲体系中表现优异，更在复杂的人血清样本中得到了准确验证，特异性、重复性和稳定性俱佳，显示了强大的临床应用前景。 5. 方法学上的通用性：整个传感设计基于模块化的核酸反应和通用的金属沉积原理，为检测其他疾病标志物提供了可借鉴的范式。