三维细胞迁移分析新模型：各向异性持续随机行走（APRW）协议

作者及机构
本研究的通讯作者为约翰霍普金斯大学的Pei-Hsun Wu和Denis Wirtz，合作者包括Anjil Giri等。研究团队来自约翰霍普金斯大学化学与生物分子工程系、物理科学肿瘤中心、病理学系和肿瘤学系。该成果于2015年2月26日在线发表于*Nature Protocols*期刊（卷10，第3期，页码517-527），DOI编号10.1038/nprot.2015.030。

学术背景

研究领域与动机
细胞迁移是发育生物学、癌症转移和免疫应答的核心过程。传统上，二维（2D）平面上的细胞运动常用持续随机行走模型（Persistent Random Walk, PRW）描述，该模型假设细胞运动具有时间持续性和空间各向同性性。然而，越来越多的证据表明，细胞在三维（3D）细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）中的迁移行为与2D环境存在显著差异：
1. 力学机制差异：3D迁移依赖肌动球蛋白收缩力和微管动力学，且需要基质金属蛋白酶（MMPs）参与基质重塑；
2. 运动模式差异：3D环境中细胞呈现高度各向异性（anisotropy），而PRW模型无法捕捉这种方向偏好性。

研究目标
开发一套基于各向异性持续随机行走模型（Anisotropic PRW, APRW）的标准化分析流程，用于定量表征3D微环境中细胞迁移的动力学参数（如持久时间、扩散系数和各向异性指数），并通过实验验证其优于传统PRW模型的适用性。

研究方法与流程

实验设计与样本

研究以HT-1080人纤维肉瘤细胞为主要模型，同时验证了MDA-MB-231乳腺癌细胞、Jurkat T细胞、DU-145前列腺癌细胞和HEY卵巢癌细胞的迁移行为。细胞被嵌入不同密度（0.5–2 mg/mL）的I型胶原基质中，部分实验组使用肌动蛋白解聚药物Latrunculin B（100 nM）或肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin（15 μM）处理。

核心分析流程（7个步骤）

1. 轨迹数据准备

   • 通过时间分辨显微镜记录细胞运动轨迹，导出为Excel格式，包含细胞ID、时间帧、x/y坐标（单位μm）。
     
   • 软件自动统一所有轨迹的最小帧数（nmin）以保证分析一致性。
     

2. 时间不变性验证

   • 运行get_voft.m代码计算不同时间点的细胞速度分布，确认迁移过程无时间依赖性变化（如化学梯度干扰）。
     

3. 均方位移（MSD）分析

   • 使用get_msd.m计算单个细胞的MSD曲线：
     [ \text{MSD}(\tau) = \langle [x(t+\tau)-x(t)]^2 + [y(t+\tau)-y(t)]^2 \rangle ]
     
   • 对群体轨迹进行系综平均，排除τ超过观测周期一半的数据以减少误差关联。
     

4. 速度自相关函数（ACF）

   • 通过get_acf.m分析速度方向记忆性：
     [ \text{ACF}(\Delta t) = \langle \Delta x(t)\Delta x(t+\Delta t) + \Delta y(t)\Delta y(t+\Delta t) \rangle ]
     
   • 归一化处理时忽略Δ𝑡=0和Δ𝑡=1的数据点，避免定位噪声干扰。
     

5. 位移概率密度函数（PDF-Δr）

   • get_dr_pdf.m统计特定时间滞后（如20分钟）的位移分布，发现3D迁移呈指数分布（非PRW预测的高斯分布）。
     

6. 角度变化分布（PDF-Δθ）

   • get_dtheta_pdf.m分析连续运动方向间的夹角分布，揭示3D迁移的方向偏好性（各向异性）。
     

7. 速度极化谱（dr(θ)）

   • 通过get_dr_polarity.m和奇异值分解（SVD）确定每个轨迹的主迁移轴，计算速度在不同方向的投影强度。
     

模型拟合与验证

PRW模型拟合
- 使用fit_prw.m拟合MSD曲线，得到速度（s）和持久时间（p）：
[ \text{MSD}(\tau) = 2s^2p[\tau - p(1-e^{-\tau/p})] + 4\sigma^2 ]
- 通过sim_prw.m生成模拟轨迹，与实验数据比较ACF、PDF等统计特征。

APRW模型开发
1. 方向分解：通过SVD将轨迹速度矩阵分解为主轴（p）和次轴（np），重新对齐坐标；
2. 分轴拟合：对主轴和次轴分别应用1D PRW模型，得到独立参数（sp, pp, snp, pnp）；
3. 各向异性指数：计算φ = dp/dnp = sp²pp/(snp²pnp)，量化方向偏好性。

主要结果

统计特征突破

1. 非高斯位移分布：HT-1080细胞在3D胶原中的位移PDF呈指数衰减（图1d），而PRW模拟结果显著偏离实验数据（图3c）；
   
2. 速度方向极化：dr(θ)显示3D迁移速度在主轴上强度高出次轴2–3倍（图1h），APRW模拟准确复现该特征（图3k）；
   
3. 药物效应量化：Latrunculin B处理使持久时间（pp）从14.5±16.6分钟降至14.3±18.6分钟（表2），但各向异性指数φ仅从13.6降至8.5（图4f），表明肌动蛋白破坏主要影响运动持续性而非方向性。
   

模型性能对比

如表1所示，APRW对11种细胞/条件的拟合优度（R²）普遍优于PRW：
- 对HT-1080细胞的3D迁移，APRW的PDF-Δr拟合R²达0.78（PRW仅0.57）；
- 但对Jurkat T细胞的2D迁移，两种模型表现相近（R²≈0.8），说明APRW在3D环境中优势显著。

结论与价值

科学意义
1. 理论创新：首次证明3D细胞迁移具有本质各向异性，推翻PRW模型的各向同性假设；
2. 方法学贡献：提供开源MATLAB工具包（补充软件），实现全自动化分析（<30分钟/条件）。

应用前景
1. 癌症研究：量化侵袭性细胞（如MDA-MB-231）的3D迁移参数，助力转移机制解析；
2. 药物筛选：通过φ指数评估细胞运动方向性，为抗迁移药物开发提供新指标。

研究亮点

1. 多尺度统计验证：联合MSD、ACF、PDF和极化谱分析，全面刻画迁移动力学；
   
2. 跨模型对比：通过PRW与APRW的模拟轨迹对比，凸显后者在3D环境中的必要性；
   
3. 广泛适用性：协议已验证于5种细胞类型和3种基质条件，涵盖肿瘤、免疫细胞等。
   

局限性

1. 2D投影偏差：分析基于2D显微镜轨迹，可能低估真实3D运动的绝对参数值；
   
2. 梯度限制：模型不适用于趋化性或趋硬性等有梯度环境下的迁移分析。
   

（注：文中所有代码及示例数据可通过*Nature Protocols*补充材料获取）