本研究报告介绍了发表于 Angewandte Chemie International Edition 的一项原始研究，题为“Ribozyme redesign from an existing RNA scaffold enables multifunctional hydrolysis for molecular release”。该研究由中山大学化学学院生物无机与合成化学教育部重点实验室及中山大学孙逸仙纪念医院等机构的研究人员完成，主要作者包括 Jun Yan、Yuan-Lin He、Chen-Xi Zhang、Sen-Lin Ye、Xiao-Hui Li、Feng-Tai Wu、Liang-Liang Wang、Lin Huang 和 Liang Xu。通讯作者为 Lin Huang 和 Liang Xu。论文于2026年7月17日投稿，同年10月21日修订，10月23日被接收，DOI 为 10.1002/anie.4905134。

该研究属于 RNA 催化与核酶工程领域，聚焦于如何通过对已有核酶结构的定向改造赋予其全新的催化功能。RNA 世界假说认为 RNA 在生命起源中扮演了核心角色，RNA 催化能力是该假说的重要支柱。目前已知的核酶能够催化磷酸二酯键的形成与断裂、肽键形成以及近年发现的多种烷基转移反应。然而，新核酶的获得主要依赖自然或人工选择的缓慢随机过程。已有的核酶工程策略多用于优化已有活性，而很少能够从根本上赋予核酶全新的催化化学。蛋白质酶中常见的一个现象是，相似的结构骨架能够通过少数关键残基的突变而被重新利用，催化截然不同的反应，但这一理念在核酶工程中尚未被充分探索。因此，本研究的核心目标是：是否能够仅通过最小限度的序列改变，在已有核酶骨架上理性设计出全新的催化功能。具体而言，作者尝试将一个已知的甲基转移核酶 MTR1 通过单核苷酸突变转化为一个多功能水解核酶。

研究的详细流程可以分为多个层次。首先，作者基于 MTR1 的催化机制提出了一个假设。MTR1 以鸟嘌呤衍生物为辅因子介导烷基转移，烷基转移需要在鸟嘌呤碱基质子化后产生良好的离去基团，随后腺嘌呤 N1 进行亲核攻击。作者设想如果将烷基底物替换为酰基底物，理论上也应该提供有效的亲电位点，从而可能发生酰基转移，生成 1-酰基腺嘌呤。由于 1-酰基腺嘌呤可能热力学上不如烷基化产物稳定，其后续水解可能推动整体反应，最终释放羧酸。为了验证这一假设，作者合成了 O6-苯甲酰鸟嘌呤作为底物，并以 MTR1 作为催化剂进行反应，通过 HPLC 监测鸟嘌呤和苯甲酸的生成。结果表明 MTR1 确实能催化酯水解，尽管初始转化率仅约 7%。

然而，进一步的关键实验发现，将催化口袋中关键的腺苷 A67 突变为其他核苷时，并未如预期使催化活性消失。G 突变体和 U 突变体仍分别保留约 20% 和 10% 的转化率，而 C 突变体则显著增强活性，在酶与底物比为 1:10 的条件下，30 分钟内实现约 77% 的转化率。动力学监测显示胞苷突变体在所有变体中具有最快的速率和最高的转化率。Michaelis–Menten 分析表明，该新型核酶在核酶浓度为 5 μM 时，Vmax 为 (8.6 ± 0.5) μM/min，Km 为 (21 ± 4) μM，表现出经典蛋白酶的多周转特征。这些结果否定了最初的酰基转移机制假设，表明单核苷酸突变已将 MTR1 转化为一种具有不同催化机制的新型酯水解核酶，命名为 EHR。

随后，研究团队系统考察了 EHR 的底物范围。实验表明，EHR 不仅能水解 O6-苯甲酰鸟嘌呤，还能水解多种羧酸酯底物，包括芳香族和脂肪族羧酸酯。此外，EHR 还能切割碳酸酯键，从而释放胺基或羟基。更复杂的功能分子释放实验也取得成功：通过碳酸酯键连接的鸟嘌呤笼化香豆素在 10% 催化剂条件下，30 分钟内实现约 86% 的释放；荧光光谱实时监测显示去笼化恢复了香豆素的天然荧光。在药物释放方面，EHR 能有效再生氨苄青霉素和甲氨蝶呤的天然形式，产率分别为 88% 和 78%。

为阐明 EHR 的催化机制，研究团队采用 X 射线晶体学解析了 EHR 与 O6-乙酰鸟嘌呤底物复合物的三维结构，分辨率达 2.69 Å，PDB 编号为 21ld。结构显示 EHR 与 MTR1 的整体折叠高度相似，RMSD 为 0.623 Å，催化结构域基本一致。鸟嘌呤位于催化口袋中心，与 C12、C7 和 U42 形成多重氢键。电子密度图中未观察到乙酰基，说明水解反应已完成。关键的是，C7 的 N3 与鸟嘌呤 O6 之间的距离为 4.4 Å，过远而无法直接进行亲核攻击。结合分子动力学模拟，作者提出了水介导的酯水解机制：A7C 突变增大了活性位点空间，允许更多水分子进入；一个水分子在 C7 的 N3 活化下去质子化并攻击羰基碳，另一个水分子与羰基氧形成氢键增强亲电性。进一步的动力学突变分析支持该机制：C7 突变为 A、G、U 均显著降低催化效率，其中 U 突变使 kobs 下降超过 140 倍；原子级胞嘧啶突变 V1 和 V2 也大幅削弱活性。pH 依赖性实验显示 EHR 在 pH 6.0–8.0 范围内活性相对稳定，与 MTR1 需要酸性条件形成鲜明对比，反映了水分子活化与鸟嘌呤质子化之间的平衡。

在细胞应用方面，研究首先通过 tRNA 支架在大肠杆菌中表达 EHR，证实其能在细胞内水解笼化的氨苄青霉素，恢复抗生素活性并抑制细菌生长。随后，研究采用扭转核酶介导的 RNA 环化策略在哺乳动物细胞中实现 EHR 的高效表达。在 HEK293T 细胞中，EHR 能选择性水解笼化香豆素，使表达 EHR 的细胞产生蓝色荧光，而对照细胞无显著荧光。在 MDA-MB-231 和 HeLa 细胞中，EHR 能在早期时间点恢复笼化甲氨蝶呤的细胞毒性，表明其可在细胞内控制药物活性。为进一步实现细胞特异性操控，研究利用 GFAP 启动子驱动 EHR 在 C8-D1A 细胞中特异性表达，而在 HEK293T 细胞中不表达。结果显示，在笼化甲氨蝶呤处理后，仅 C8-D1A 细胞活力被显著抑制，HEK293T 细胞不受影响，证明通过细胞特异性启动子控制 EHR 表达可实现前药的靶向激活和选择性细胞毒性。

此外，研究还发现 EHR 能够催化醚键水解。O6-甲基鸟嘌呤和 O6-苄基鸟嘌呤在 10% 核酶催化剂下分别实现约 18% 和 30% 的鸟嘌呤生成。质谱分析表明 EHR 自身未发生烷基化。Michaelis–Menten 分析显示 O6-苄基鸟嘌呤的 Vmax 为 (4.0 ± 0.5) μM/min，Km 为 (140 ± 40) μM，整体效率低于酯底物但仍在分钟级时间尺度。关键突变体实验证实 C7 和 C12 对醚水解同样至关重要。因此，EHR 应被重新定义为酯/醚水解核酶。

本研究的核心结论是：单核苷酸突变能够将已有的烷基转移核酶重新编程为一个新的多功能水解核酶，且无需改变整体 RNA 催化骨架。这一发现揭示了 RNA 催化结构中此前被低估的多功能性，为核酶工程提供了一种全新的理性设计思路。与蛋白质酶类似，RNA 也能利用相同或相似的催化组织执行不同的化学反应，这对于理解 RNA 世界假说中早期生命如何经济高效地扩展催化功能具有重要意义。在应用层面，EHR 能够在活细胞内实现可控的荧光分子和药物分子的选择性激活与释放，为细胞特异性识别与调控提供了新的 RNA 工具。不过，作者也指出酯键在细胞环境中固有的不稳定性可能导致长时间孵育后的背景泄漏，因此酯水解释放更适合快速细胞响应场景；而醚键稳定性更高，适合需要长期持续作用的释放策略。

本研究的亮点主要体现在以下方面：第一，证明了核酶重新设计而非分子进化即可产生全新催化活性，且只需一个核苷酸的改变；第二，实现了从烷基转移酶到水解酶的功能重编程，同时保留整体催化骨架；第三，系统阐明了一种水介导的酯/醚水解机制，揭示了两个胞苷残基分别作为广义酸和碱的关键作用；第四，在活细胞中成功展示了核酶介导的前药激活和细胞选择性操控，拓展了核酶在非核酸过程的应用。该工作为核酶催化的理性设计与多功能化应用开辟了新方向。