本研究由Ram Hari Pokhrel、Suman Acharya、Jae-hee Ahn等研究人员共同完成，他们分别来自韩国岭南大学药学院（Yeungnam University）和江原国立大学药学院（Kangwon National University）。研究论文题为“AMPK promotes antitumor immunity by downregulating PD-1 in regulatory T cells via the HMGCR/p38 signaling pathway”，发表于国际知名期刊Mol Cancer，于2021年正式在线发表。
研究的学术背景 本研究的科学领域聚焦于肿瘤免疫学与细胞代谢的交叉领域。具体而言，它关注调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）在肿瘤微环境中的功能调控及其代谢基础。Tregs是肿瘤免疫抑制的主要执行者之一，其功能受到细胞内部代谢状态的高度调节。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是细胞中关键的代谢感受器和能量稳态调节因子，已知在多种癌症中发挥肿瘤抑制作用。然而，AMPK在调节抗肿瘤免疫，特别是在调控肿瘤浸润性Tregs功能方面的具体作用，此前尚不明确。此外，程序性死亡受体1（Programmed cell death 1, PD-1）作为关键的免疫检查点分子，在Tregs上的表达调控机制也不清晰。有前期研究表明，糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK3β）的抑制能够降低CD8+ T细胞上的PD-1表达，但GSK3β与PD-1在Tregs中的调控关系未知。基于此，本研究旨在探究AMPK在Tregs中对PD-1表达的调控作用及其具体分子机制，并评估靶向该通路在肿瘤免疫治疗中的潜在应用价值。研究的目标是揭示一个连接细胞代谢与免疫检查点表达的新信号轴。
详细研究流程 本研究采用了多层次、多技术的综合性实验策略，主要流程可概括为：动物模型构建与表型验证、分子表达与功能分析、信号通路机制解析、以及治疗潜力评估。
首先，在动物模型构建阶段，研究人员通过基因工程手段，将携带loxP-flanked Prkaa1基因（编码AMPKα1亚基）的小鼠与Foxp3YFP-Cre小鼠进行杂交，成功构建了Treg细胞特异性敲除AMPKα1的小鼠模型（简称Ampkfl/flFoxp3-Cre小鼠或AMPK-KO）。同时，以Foxp3-Cre小鼠作为野生型对照（WT）。研究使用的小鼠还包括Rag1-/-免疫缺陷鼠和C57BL/6J背景鼠。在肿瘤模型中，分别向这些小鼠皮下接种了三种同源肿瘤细胞系：B16F10黑色素瘤细胞（2.5×10^5个）、TC-1宫颈癌细胞（1×10^6个）和MC38结肠癌细胞（2.5×10^5个）。肿瘤生长情况通过游标卡尺定期测量，并按公式计算体积。为了评估免疫治疗的效果，在肿瘤接种后的特定时间点，对小鼠腹腔注射抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、AMPK激活剂AICAR、HMGCR抑制剂他汀类药物（Statin）以及各种信号通路抑制剂（如P38 MAPK抑制剂SB203580、GSK3β抑制剂SB216763）等。
其次，在分子与功能分析阶段，研究人员运用了多种技术手段。通过流式细胞术（Flow cytometry）和细胞分选技术，从脾脏、淋巴结和肿瘤组织中分离并分析了Tregs、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等免疫细胞亚群的频率、数量及表面分子（如PD-1、CTLA-4、NRP1、ICOS等）的表达水平。同时，还检测了细胞内细胞因子（如IFN-γ、IL-10、Granzyme B）的表达。为了评估体内细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性，采用了基于细胞示踪染料（Cell Trace Violet）的体内杀伤实验。体外实验方面，通过Tregs抑制实验（CFSE标记的效应T细胞与Tregs共培养）评估了Tregs的免疫抑制功能。在分子水平，使用蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术检测了Tregs中AMPK、PD-1、HMGCR、p38 MAPK、GSK3β、β-catenin等关键蛋白的表达及其磷酸化状态。免疫共沉淀（Immunoprecipitation）技术用于验证AMPK与HMGCR、p38与GSK3β之间的直接相互作用。实时定量PCR（qRT-PCR）用于检测相关基因的mRNA表达水平。此外，还进行了糖酵解速率测定（Glycolysis assay）以评估Tregs的能量代谢状态。在数据分析层面，除了对实验数据的常规统计分析，研究还利用公共数据库（如TCGA、GEO）的单细胞RNA-seq和bulk RNA-seq数据，分析了癌症患者样本中AMPK亚基基因与PDCD1（PD-1编码基因）表达的相关性，为临床相关性提供了支持。
主要研究结果 研究结果层层递进，揭示了AMPK通过一条清晰的信号通路负向调控Tregs中PD-1表达的完整机制。
首先，研究人员发现，在荷瘤小鼠的肿瘤浸润Tregs中，AMPK的表达水平显著低于无瘤小鼠的外周Tregs。通过分析公共数据库，他们发现癌症患者Tregs中AMPK亚基基因（如PRKAA1）的表达与PDCD1的表达呈显著负相关。这提示AMPK可能抑制Tregs中PD-1的表达。
其次，在功能表型上，Treg特异性敲除AMPK的小鼠（AMPK-KO）在接种B16F10、TC-1、MC38肿瘤后，肿瘤生长速度显著快于野生型对照小鼠。进一步分析发现，AMPK-KO小鼠肿瘤内CD4+和CD8+效应T细胞的浸润减少，其产生IFN-γ和Granzyme B的能力下降，体内CTL活性也减弱。然而，肿瘤内Tregs的比例并未改变，但其细胞数量和增殖能力增强。这些结果表明，AMPK在Tregs中的缺失通过削弱抗肿瘤T细胞反应促进了肿瘤生长。
第三，在分子机制探索中，研究发现AMPK-KO的Tregs高表达PD-1，同时也高表达NRP1和ICOS等抑制性分子。使用AMPK抑制剂Compound C处理野生型Tregs会上调PD-1表达，而使用AMPK激活剂AICAR或二甲双胍（Metformin）处理则会下调PD-1表达。体外抑制实验证实，AMPK-KO的Tregs具有更强的抑制效应T细胞增殖的能力，并产生更多的免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β。这表明AMPK通过抑制PD-1等分子的表达来限制Tregs的免疫抑制功能。
第四，研究深入探究了AMPK调控PD-1的上游代谢信号。他们发现AMPK缺失的Tregs糖酵解增强，同时3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）的表达和活性形式（去磷酸化）显著增加。HMGCR是甲羟戊酸通路的关键限速酶。免疫共沉淀证明AMPK可以与HMGCR结合。在治疗上，联合使用AMPK激活剂AICAR和HMGCR抑制剂他汀（Statin）能协同抑制肿瘤生长，并更有效地降低Tregs上的PD-1表达，且此效应依赖于适应性免疫系统（在Rag1-/-鼠中无效）。这说明AMPK通过抑制HMGCR来发挥作用。
第五，为了寻找HMGCR下游的信号，研究人员发现AMPK的缺失或HMGCR的激活会导致p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化（激活）水平下降。相反，激活AMPK或抑制HMGCR能增强p38的磷酸化。使用p38抑制剂SB203580处理会上调Tregs的PD-1表达并促进肿瘤生长，表明p38是PD-1表达的负调控因子。
第六，研究进一步确定了p38的下游靶点。已知p38可以通过磷酸化并抑制GSK3β的活性。实验结果显示，在AMPK-KO的Tregs中，磷酸化的GSK3β（失活形式）减少，而总GSK3β（活性形式）积累，其下游靶标β-catenin的磷酸化（降解信号）增加而总蛋白减少。这表明AMPK缺失导致GSK3β活性增强。免疫共沉淀证实p38与GSK3β存在相互作用。使用GSK3β抑制剂处理可以部分逆转AMPK-KO Tregs中PD-1的高表达。同时，GSK3β的活性还负向调控转录因子T-bet的表达，而T-bet已知能抑制PD-1。因此，完整的信号通路得以阐明：AMPK通过抑制HMGCR，激活p38 MAPK，进而磷酸化并抑制GSK3β。GSK3β活性的降低，一方面可能通过稳定β-catenin，另一方面可能通过上调T-bet，最终导致PD-1在Tregs上的表达下调。
研究结论 本研究的结论是，AMPK在Tregs中扮演着连接代谢与免疫功能的关键角色。它通过一条新颖的“AMPK–HMGCR–p38 MAPK–GSK3β”信号轴，负向调控免疫检查点分子PD-1的表达。AMPK功能的丧失会解除对这条通路的抑制，导致Tregs上PD-1表达升高，进而增强其免疫抑制能力，损害抗肿瘤免疫应答，最终加速肿瘤进展。这项研究不仅揭示了Tregs功能调控的一个核心代谢-免疫检查点交叉对话机制，还为改善现有肿瘤免疫治疗策略提供了新的思路。
研究的价值与意义 本研究的科学价值在于首次系统性地阐述了AMPK在肿瘤微环境中调控Tregs功能的具体分子途径，将能量感知、胆固醇代谢前体通路（甲羟戊酸通路）的关键酶HMGCR、经典的应激/炎症信号p38 MAPK、以及多功能的激酶GSK3β串联起来，共同指向对免疫检查点PD-1的调控，形成了一个完整的信号网络。这加深了对肿瘤免疫代谢微环境复杂性的理解。
其应用价值尤为突出。研究提出，靶向该通路可能具有重要的治疗潜力。具体而言：1）AMPK激活剂（如AICAR、二甲双胍）能够与现有的免疫检查点阻断疗法（抗PD-1、抗CTLA-4抗体）产生协同抗肿瘤效应。2）临床上广泛使用的降胆固醇药物他汀类（HMGCR抑制剂）与AMPK激活剂联用，也展现出协同治疗效果。这为将代谢调节药物“老药新用”，与免疫疗法进行联合，以提高疗效、克服耐药提供了直接的理论和临床前实验依据。
研究的亮点 本研究的亮点包括：1. 机制新颖性：首次揭示AMPK通过HMGCR/p38/GSK3β轴调控Tregs上PD-1表达的完整通路，是代谢与免疫检查点交叉研究的重要突破。2. 研究策略系统全面：从动物模型表型到细胞分子机制，从体外实验到体内验证，并辅以临床数据库分析，构建了完整的证据链。3. 强大的转化医学潜力：研究结论直接指向了两种具有高度临床可行性的联合治疗策略（AMPK激活剂+免疫检查点抑制剂；AMPK激活剂+他汀），为肿瘤免疫治疗的优化提供了新的方向。4. 技术方法综合运用：熟练结合了遗传学小鼠模型、多参数流式分析、代谢测定、分子互作验证等多种前沿技术，有力支撑了复杂科学问题的解析。5. 明确的临床相关性：利用公共基因表达数据库，将小鼠模型中发现的现象与人类癌症患者的基因表达特征相关联，增强了研究的说服力和临床意义。